이 프로토콜은 생리학적 또는 병리학적 상태에 두개골 dura mater의 복잡한 신경 혈관 구조를 이해하기 위한 가변 방법론적 참조를 제공할 수 있다. 투명한 전체 탈산 듀라 마터를 활용하여, 듀럴 CGRP 면역 반응성 신경 섬유 및 혈관의 간격 상관 관계는 3D 보기에서 입증될 수 있다. 쥐를 안락사한 후, 트랜스카르티가 0.9%의 정상 식염수 100밀리리터로, 0.1 개의 어금니 인산염 버퍼에서 4%의 파라포름알데히드의 250~300밀리리터가 그 뒤를 이었다.
완료되면 머리 피부를 제거하고 두개골을 열어 뇌의 두라 마터와 등쪽을 노출시하십시오. 뇌간을 따라 두개골 듀라 메이트를 전체 탈것 패턴의 후각 전구에 해부합니다. 두개골 듀라 마터를 0.1 대구 에서 0.1 대구 용으로 헹구고 블로킹 용액에 인큐베이션합니다.
하룻밤 동안 마우스 안티 CGRP 항체로 듀라 마터를 전송. 다음 날, 듀라 마터를 0.1 인산염 버퍼로 세 번 씻는다. 당나귀 항마우스 알렉사 플루어(488)의 혼합 용액에서 듀라 마터(dura mater)를 0.1에서 배양한다.
1%일반 당나귀 혈청과 0.5%트리톤 X-100을 함유한 몰인산염 버퍼는 실온에서 1.5시간 동안 이다. 이어서, 듀라 마터를 0.1 어금니 인산염 버퍼로 세 번 세척하고 가장자리를 다듬고 현미경 슬라이드에 장착한다. 관찰 하기 전에 50% 글리세린커버 슬립에 넣어.
형광 현미경으로 전체 마운트 dura mater를 이미지한 다음, 공초점 현미경을 사용하여 듀라 마터에서 CGRP 면역 반응성 신경 섬유 및 프할로이드인 표시 혈관의 이미지를 취합니다. 쥐의 머리를 전기 면도기로 면도한 다음 무딘 이어 바를 쥐에 넣고 스테레오탁스 장치에 놓습니다. 입 홀더를 배치하고 눈에 안과 연고를 적용합니다.
75%에탄올을 사용하여 머리 피부의 수술 면을 청소하고 두피의 중간선을 따라 절개를 합니다. 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골에서 멀리 간음과 근육 조직을 무뚝뚝하게 제거합니다. 왼쪽 정수리와 중간 수막 동맥 위에 측두골에 둥근 팁 비트와 버 드릴을 사용하여 작은 구멍을 드릴.
치과 규산염 시멘트로 구멍 주위에 은행을 구축하고 10 마이크로 리터 마이크로 리터 마이크로 시링으로 중간 수막 동맥 주변의 구멍에 플루오로 골드 의 두 마이크로 리터를 추가합니다. 작은 헤모성 스폰지조각으로 구멍을 덮습니다. 구멍에 파라핀 필름 조각을 넣고 뼈 왁스로 가장자리를 밀봉합니다.
멸균 실로 상처를 봉합합니다. 쥐가 완전히 회복될 때까지 따뜻한 부위에 쥐를 보관하십시오. 그런 다음 쥐를 다시 케이지로 돌려놓습니다.
7일 간의 생존 일 후에, 0.9%의 정상 식염수로 이 쥐를 perfuse, 0.1 대구피산염 완충액에 있는 4%파라포름알데히드가 그 뒤를 이었다. TG와 자궁 경부 1 ~ 4 개의 DRG를 해부한 다음 처탈 방향으로 극저온 미세 토메 시스템에서 30 마이크로 미터의 두께로 잘라냅니다. 그리고 시란 코팅 유리 슬라이드에 섹션을 마운트.
히스토케미칼 펜으로 섹션을 동그라미하고 블로킹 용액에서 30 분 동안 배양하십시오. 토끼 항 플루오로골드 및 마우스 안티 CGRP 항체의 용액으로 샘플을 전송하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양한다. 다음 날, 0.1 어금반 완충제에서 섹션을 세 번 씻는다.
당나귀 안티 토끼 알렉사 플루오 (594)와 당나귀 안티 마우스 알렉사 플루어 488 이차 항체의 혼합 용액에 세척 된 섹션을 배양. 그런 다음 0.1 어금반 완충제에서 세 번 씻고 관찰을 위해 50 % 글리세린으로 커버 슬립을 적용하십시오. 형광 현미경을 사용하여 UV 조명 아래 TG 및 DRG에 있는 형광금 표지된 뉴런의 심상을 취하십시오.
그런 다음 TG 및 DRG에서 플루오로골드 및 CGRP 라벨뉴런의 이미지를 캡처합니다. CGRP 및 phalloidin을 사용하여 면역형및 형광 조직 화학 염색 후, CGRP 면역 반응성 신경 섬유 및 프할로이드인 라벨 듀랄 동맥 및 결합 조직은 3D 패턴으로 전체 마운트 두개골 두라 메이트전체에 걸쳐 명확하게 시각화되었다. 두껍고 얇은 CGRP 면역 반응성 신경 섬유는 혈관 벽 주위 또는 혈관 사이 의 두막 동맥에 병렬로 실행됩니다.
중간 수막 동맥 및 쥐 두개골 두루마 메이트의 영역에 형광골드 적용 후 7 일, 형광 미세 검사의 UV 조명에서 직접 관찰 된 추적자 응용 프로그램의 ipsilateral 측에 TG 및 자궁 경부 DRGs에서 형광 표지 뉴런이 검출되었다. 플루오로골드 표지뉴런은 TG의 세 가지 모두에서 발견되었으며, 안과 및 상악 분열에 대한 농도가 높고 하악 분열에 대한 농도가 낮았습니다. 일부 플루오로골드 표지뉴런은 자궁경부에서 2~3개의 DRGs에서 관찰되었다.
이 이중 면역 형광대표 사진은 TG와 DRG에 있는 감각 신경을 보여줍니다. FG, CGRP 및 FG 및 CGRP를 가진 표지된 뉴런은 이중 면역 형광에 의해 시각화되었습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 두개골 듀라 메이트를 완전히 해부하고 전체 마운트 패턴의 슬라이드에 붙여 넣으십시오.
