이 방법은 삼차 혈관계에서 CGRP의 방출과 관련된 메커니즘을 조사하는 도구입니다. 이 방법의 주요 장점은 삼차 혈관계를 세 개의 다른 부위로 나누고 각 별개의 부위 내에서 CGRP의 방출을 평가할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 저와 우리 그룹의 선임 과학자 인 Inger Jansen-Olesen이 될 것입니다.
시작하려면 가위를 사용하여 머리와 목 주위의 피부와 근육을 제거하여 쥐 조직을 준비하십시오. 다음으로 뼈 트리머와 가위를 사용하여 아래턱을 머리에서 분리하십시오. 이제 척추의 등쪽 부분에 꼬리로 뼈 트리머를 삽입하여 척수와 뇌간을 노출시키고 제거합니다.
그런 다음 두개골의 꼬리 부분을 후두골과 정수리 뼈의 경계로 잘라 이러한 뼈 구조를 제거하여 소뇌를 노출시킵니다. 양쪽의 브레그마에서 약 13-16mm 떨어진 꼬리로 달리는 TNC를 분리하려면 스프링 가위로 뇌간의 등측 부분을 자릅니다. 그런 다음 왼쪽과 오른쪽 TNC를 SIF에 담그십시오.
다음으로, 톱을 사용하여 두개골을 두 개로 나누기 위해 머리를 중간 처짐으로 자릅니다. 이제 주걱을 사용하여 두개골에 부착 된 경막을 건드리지 않고 조심스럽게 뇌를 제거하십시오. TG를 분리하려면 하악 가지가 난소 구멍으로 들어가고 안과 및 상악 가지가 두개골로 들어가는 시각적 경계 주변의 가지를 포함하여 절단하십시오.
그런 다음 두개골 반쪽과 TG를 SIF에 담그십시오. 마우스 조직을 준비하려면 가위를 사용하여 머리와 목 주위의 피부와 근육을 제거하십시오. 이제 척추의 등쪽 부분에 꼬리로 가위를 삽입하여 척수와 뇌간을 노출시키고 제거합니다.
그런 다음 두개골의 꼬리 부분을 후두골과 정수리 뼈의 경계로 잘라 소뇌를 노출시키는 이러한 뼈 구조를 제거합니다. 정수리 뼈를 중간 처짐으로 자르고 뼈를 제거하여 대뇌를 노출시킵니다. 주걱을 사용하여 뇌간을 노출시키기 위해 소뇌를 조심스럽게 제거하십시오.
뇌간의 일부가 포함 된 TNC를 스프링 가위로 분리 한 다음 뇌간을 SIF에 담그십시오. 이제 주걱을 사용하여 조심스럽게 뇌를 제거하고 뇌간에 들어가는 삼차 신경을 자릅니다. TG를 분리하려면 난소 구멍으로 들어가는 하악 가지와 두개골로 들어가는 안과 및 상악 가지가있는 시각적 경계 주변의 가지를 포함하여 절단하십시오.
다음으로 TG를 SIF에 담그십시오. SIF를 쉽게 교환하려면 플라스틱 용기에 톨 뚜껑을 추가하고 5분마다 SIF를 교체하여 SIF에서 30분 동안 쥐와 마우스 조직을 세척하기 시작합니다. 실온에서 30 분 동안 세척 한 후 쥐 TNC 반쪽과 쥐 TG를 350 마이크로 리터의 SIF로 마이크로 원심 분리 튜브 캡으로 분리합니다.
TNC가 있는 마우스 뇌간을 250마이크로리터의 SIF가 있는 미세원심분리기 튜브 캡으로 옮깁니다. 마지막으로 두 개의 마우스 TG를 250마이크로리터의 SIF가 있는 마이크로원심분리 튜브 캡으로 옮깁니다. 쥐 두개골 반쪽을 6웰 배양 접시에 놓고 두개골을 400마이크로리터의 SIF로 채웁니다.
쥐와 쥐 조직이 있는 미세 원심분리기 튜브 캡에 쥐 두개골을 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 놓습니다. 조직을 건드리지 않고 20분 동안 5분마다 피펫을 사용하여 SIF를 교체합니다. 적절한 라벨링을 통해 샘플 수집을 위한 미세 원심분리 튜브를 준비합니다.
그런 다음 각 마이크로 원심 분리 튜브에 50 마이크로 리터의 10 강도 EIA 버퍼를 추가합니다. 다음에, 모든 농도에 대해 SIF에서 희석하여 시험 화합물 용액 및 비히클 용액을 준비한다. 마지막 세척 후, 250 마이크로리터의 SIF를 마우스 TG 및 TNC에, 350 마이크로리터의 SIF를 래트 TG 및 TNC에, 및 400 마이크로리터의 SIF를 각각의 래트 두개골에 첨가한다.
10분 배양 후, 기저 CGRP 방출을 측정할 수 있도록 50마이크로리터의 10 강도 EIA 버퍼가 있는 사전 라벨링된 마이크로원심분리 튜브에서 200마이크로리터의 샘플을 수집합니다. 남은 액체를 버리고 즉시 섭씨 영하 20도에서 샘플을 보관하십시오. 가장 낮은 농도부터 시작하여 증가하는 농도로 상응하는 비히클에 시험 화합물을 추가하고 10분 동안 배양합니다.
10 분의 배양 후, 50 마이크로 리터의 10 강도 EIA 완충액이있는 사전 표지 된 마이크로 원심 분리 튜브에서 200 마이크로 리터의 샘플을 수집합니다. 남은 액체를 버리고 두 번째로 낮은 농도를 조직에 첨가하십시오. 즉시 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하고 나머지 농도로이 절차를 반복하십시오.
실험에 대한 양성 대조군을 수행하려면 프로토콜의 끝에서 양성 대조군을 조직에 추가합니다. 10분의 인큐베이션 기간 후, 50 마이크로리터의 10 강도 EIA 완충액이 있는 마이크로원심분리 튜브에서 200 마이크로리터 샘플을 수집한다. 수집 된 샘플에서 방출 된 CGRP의 농도는 EIA 키트와 함께 제공된 제조업체의 지침에 따라 EIA 키트를 사용하여 측정됩니다.
래트에서, 캡사이신 노출은 비히클에 비해 경막 및 TG로부터 유의한 CGRP 방출을 유도하였다. 경막에서, CGRP의 최대 방출은 캡사이신의 1 마이크로 몰에서 발견되었다. TG에서, 최대 CGRP 방출은 캡사이신의 10 마이크로몰에서 발견되었다.
일원 분산 분석으로 분석했을 때, 글리벤클라미드는 경막 및 TG로부터의 기저 CGRP 방출에 영향을 미치지 않는다. 글리벤클라마이드는 단방향 ANOVA로 분석했을 때 비히클을 사용한 캡사이신에 비해 경막에서 캡사이신 유도 CGRP 방출을 40%, TG를 39% 유의하게 감소시켰습니다. 일시적인 수용체 전위 Ankyrin-1 작용제 슈퍼 신남알데히드는 1, 10 및 100 마이크로몰의 슈퍼 신남알데히드와 함께 TG에서 농도 의존적 방식으로 CGRP를 방출하는 것으로 밝혀졌으며 이로 인해 양방향 ANOVA로 분석했을 때 비히클에 비해 CGRP의 방출이 각각 9%52% 및 69% 증가했습니다. CGRP의 증가 된 방출은 일시적인 수용체 잠재적 인 Ankyrin-1 녹아웃 마우스에서 TG에 없었으며, 1, 10 및 100 마이크로 몰의 슈퍼 신남 알데히드에 노출되어 양방향 ANOVA로 분석 할 때 비히클과 비교하여 CGRP의 방출이 각각 11 % 마이너스 13 % 및 9 % 변화되었습니다.
샘플 수집 중에 조직을 만지지 않도록 주의하고 모든 샘플의 배양 시간을 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 적절한 ELISA 키트를 사용할 수 있는 경우 이 절차를 적용하여 삼차 혈관계에 존재하는 다른 펩타이드의 방출을 측정할 수 있습니다.
