FAP는 근육 재생 및 병리학 섬유증의 중재자이기 때문에, 우리의 프로토콜은 FAP 역학의 특성화를 허용합니다 근육 상해 및 시험관 내 또는 전 생체 연구에 대한 FAP의 격리를 게시. 현재까지, 연구는 쥐에서 분리 된 FAP에 독점적으로 수행되었습니다. 우리의 프로토콜은 더 큰 쥐에서 FAP의 효과적인 격리를 가능하게, 다운 스트림 분석에 대한 훨씬 더 큰 조직 가용성을 제공.
장기간 된 조직 처리 시간은 FAP의 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 여러 샘플이 동시에 처리되는 경우 두 명의 작업자가 격리된 셀 생존 가능성을 최대화하기 위해 프로토콜을 나란히 수행하는 것이 좋습니다. 먼저 수확한 근육 조직을 멸균 10센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다.
부드럽게 찢어서 집게로 조직을 다진 다음 결합 조직을 제거하여 약 3~4밀리미터 의 큐브 조각을 얻습니다. 민스터 조직을 DMEM 6밀리리터 및 1%페니실린-연쇄절제술을 함유한 멸균 50밀리리터 원내튜브로 이송한다. 다음으로 300밀리알라 칼슘 염화칼슘 용액 10마이크로리터를 추가하여 콜라게나아제 II 용액 365마이크로리터를 활성화합니다.
밀리리터당 250단위의 최종 농도를 위해 활성 콜라게나아제 II 용액을 조직 슬러리에 추가합니다. 튜브를 1시간 동안, 240xg의 섭씨 37도에서 튜브 측면에 부착된 조직을 빼내기 위해 15분마다 수동 교반을 사용합니다. 1시간 동안 잠복한 후 콜라게나아제 II 100마이크로리터와 50마이크로리터의 디스파를 샘플에 추가합니다.
그런 다음, 파이펫은 용액이 균일할 때까지 혈청 피펫으로 15~20회 샘플링합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 30분, 15분마다 수동 교반으로 240xg의 배양합니다. 10사이클 동안 20게이지 바늘로 20밀리리터 주사기를 통해 근육 용액 샘플을 천천히 전단합니다.
그런 다음 멸균 50 밀리리터 원내 튜브에 40미크론 셀 스트레이너를 배치하고 10%의 FBS와 1%페니실린-연쇄절제술을 보충한 DMEM의 5밀리리터를 배관하여 적십니다. 스트레이너를 통해 한 번에 1 밀리리터의 샘플을 피펫합니다. 전체 샘플을 여과하면, 10%의 FBS와 1%페니실린-연쇄 절제술로 보충된 DMEM으로 세포 스트레이너를 세척하여 총 샘플 량을 25 밀리리터로 가져옵니다.
샘플 볼륨을 섭씨 15도, 400 x g에서 15분간 2개의 15밀리리터 원심튜브와 원심분리기로 균등하게 분할합니다. 원심 분리 후, 상류체를 흡인하고 7 분 동안 실온에서 RBC 용해 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 재연합니다. 그런 다음 9 밀리리터의 워시 버퍼를 추가하여 10 밀리리터와 원심분리기의 15도, 15분 동안 400 x g의 부피를 가져옵니다.
원심 분리 후, 슈퍼나탄을 흡인하고 펠릿을 세척 버퍼 1밀리리터로 재보펜한다. 별도의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 적절한 양의 세포를 전송하고 트라이판 블루 염료와 혼합합니다. 혈전계를 사용하여 가벼운 현미경으로 살아있는 세포를 계산합니다.
유동 세포측정을 위해 실험 샘플당 1~200만 개의 세포를 멸균 1.5밀리리터 미세센심분리기 튜브로 이송한다. 세척 버퍼로 샘플 볼륨을 1 밀리리터로 가져와 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 실험에 대한 모든 컨트롤을 설정합니다.
세포 컨트롤의 경우, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브의 세척 버퍼 1 밀리리터에서 알리쿼트 500, 000 ~ 1백만 개의 세포가 얼음 위에 놓습니다. 실험이 처음으로 수행되는 경우, 단하나 염색된 세포 현탁액도 포함되어야 한다. 비드 컨트롤을 설정하려면 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 약 150, 000개의 긍정적인 보상 구슬을 추가합니다.
1.5 밀리리터 미세 센심 분리제 튜브를 새로 고치도록 생존성 튜브로부터 세포 부피의 절반을 전달하여 생존 력 조절을 준비합니다. 죽은 튜브를 섭씨 65도에서 2~3분간 배양한 다음 얼음 위에 놓습니다. 인큐베이션 후 죽은 세포를 생존 튜브로 되돌리십시오.
원심분리기는 500 x g및 섭씨 4도에서 500 x g 및 섭씨 4도에서 실험 및 제어 샘플을 포함하는 단일 세포 현탁액을 원심분리하고, 상피탄을 흡입한 후 세척 버퍼100 마이크로리터로 세포 펠릿을 재연한다. 제어 또는 실험 조건에 따라 항체를 추가하고 샘플을 부드럽게 쓸어 서 완전한 혼합을 보장합니다. 그런 다음 어둠 속에서 얼음에 15 분 동안 배양하십시오.
보상 구슬의 경우 어두운 실온에서 15 분 동안 튜브를 배양하십시오. 단일 셀 서스펜션에 900 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 보상 비드 컨트롤을 위해 PBS의 900 마이크로리터를 추가하여 각 샘플의 부피를 1 밀리리터로 가져옵니다. 원심분리기 단일 셀 서스펜션은 5분 동안 500 x g, 섭씨 4도, 보상 비드 컨트롤은 300 x g, 섭씨 4도에서 5분간 보정합니다.
시료의 원심분리 후, 300 마이크로리터의 세척 버퍼에서 체퍼를 흡인하고 세포 펠릿을 재연하고, PBS 및 150, 000 개의 음의 보상 구슬의 300 마이크로 리터에서 비드 컨트롤을 억제합니다. 셀 샘플을 알루미늄 호일 아래 실온에서 얼음과 비드 샘플에 보관하십시오. 섬유-사이포겐성 선조및 근생선조를 식별하기 위하여 게이팅 전략을 설정하여 유동 세포측정 취득을 진행합니다.
대표적인 분석에서, 건강한 쥐 위트로네미즘 근육에서 생성된 보상 구슬 및 세포 현탁액의 단일 염색을 가진 Sca-1 APC 항체의 성공적인 결합이 확인되었다. Sca-1 APC의 5개의 상이한 농도는 단세포 현탁액에 적정되었고, 항체의 최적 농도는 최소한의 배경 염색을 가진 가장 큰 형광 강도를 기반으로 확인되었다. 쥐 위장혈증에서 FAP와 의원의 흐름 세포 식별은 여기에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 수행되었다.
샘플은 먼저 구슬을 계산하는 파편을 제외하기 위해 문이 있었습니다. 그런 다음 세포는 전면 분산 및 측면 분산 특성모두에 의해 이중을 배제하기 위해 게이트되었습니다. 결과 세포의 생존력은 SYTOX 블루로 염색하여 평가되었다.
SYTOX 블루 네거티브 싱글은 CD31 및 CD45에 대해 평가되어 Lin+분획을 제외했습니다. 린 인구는 평가되었다. Sca-1에 대한 단일 양성 세포는 FAP로 지정되었고, VCAM-1에 대한 단일 양성세포는 의원을 지정하였다.
분류 직후 의면염색을 통해 FAP의 갓 분리된 인구는 Pax7 양성 세포에 의한 오염 없이 PDGF랄마에 대한 긍정적인 염색을 표시했습니다. 반대로, 의원의 정렬 된 인구는 PDGFRalpha 양성 세포의 부재와 Pax7에 대한 긍정적 인 스테인드. FAP는 섬유아세포 특이단백질 1과 페리립핀 1의 발현을 각각 발현하는 사이포겐성 분화 매체에서 12일째에 분화된 섬유아세포와 사이포세포를 시연했다.
성숙한 지방세포에서 중성 트리글리세라이드와 지질의 존재는 오일 레드 O 염색으로 분명하게 드러났습니다. 추가적으로, FAP는 콜라겐 타입 I의 존재 및 심근세포 오염의 부재를 보여주었습니다. 12일 근생분암매체에서 자란 의원들은 성숙한 심낭과 융합된 다중핵심튜브의 존재를 보여주었으며, 섬유아세포와 세포질 오염이 분명했다.
이 기술을 사용하여 장기 배양을 위해 살아있는 세포를 격리할 때, 연구원은 좋은 세포 생존성을 보장하기 위하여 동시에 효율적으로 작동하는 동안 무균 기술을 사용하는 것을 확인해야 합니다.
