이 프로토콜은 분류의 형광 활성화제를 사용하여 섬유지방형성, 전구세포, 및 근육 줄기세포의 동시 분리를 위한 방법을 설명한다. 이 세포의 순수한 집단은 생리적 및 병리학 적 조건에서 생물학적 역할을 이해하기위한 전제 조건입니다. 이 기술을 사용하여 Forbes와 근육 줄기 세포를 식별하고 겨드랑이 또는 손상된 근육에서 분리했습니다.
Forbes와 근육 줄기 세포의 높은 면책으로 인해이 세포를 사카린 이식 및 진흙 혼합 분석과 같은 다양한 다운 스트림 기술에 사용할 수있었습니다. 시작하려면 안락사 된 마우스 앙와위를 해부 패드에 놓고 70 % 에탄올을 뿌립니다. 오염을 방지하려면 집게를 사용하여 마우스 배꼽 피부의 중앙을 꼬집고 수평으로 약 1cm 구멍을 자릅니다. 마우스의 상처 가장자리와 디스크를 반대 방향으로 당겨 아래 근육을 드러내고 뒷다리의 한쪽을 노출시킵니다.
근육을 수집하기 전에 대퇴사 두근의 근위 끝에있는 햄스트링 사이의 근육 간 지방을 제거하여 섬유 지방 생성 전구 세포와 근육 줄기 세포의 분리를 개선합니다. 다음으로, 조직을 손상시키지 않고 날카로운 집게를 사용하여 근막을 부수고 벗겨내어 전방 경골 또는 TA 및 신근 디지토럼 롱 또는 EDL 근육 아래를 노출시킵니다. TA EDL 근육 아래에 있는 집게의 날카로운 끝을 실행하여 경골에서 근육을 분리합니다.
힘줄을 잘라 내고 TA EDL을 발목에 부착하고 집게로 잡은 상태에서 TA EDL의 세로선을 따라 가위로 근육을 다듬습니다. 무릎 주위의 힘줄을 잘라 전체 TA EDL 근육을 분리합니다. 얼음 위에 보관 된 6 센티미터 접시에 근육을 넣으십시오.
비복근 근육을 분리하려면 발목의 모든 힘줄을 자르고 경골과 비골에서 근육을 분리하십시오. 무릎 주위를 자르고 근육을 접시에 옮깁니다. 대퇴사 두근 주위의 근막을 벗겨 내고 근육과 뼈 사이에 집게의 날카로운 끝을 움직여 대퇴골에서 분리하십시오.
무릎 주위의 힘줄을 자르고 대퇴골을 따라 절단하여 나머지 근육을 다듬고 말단에 집게로 대퇴사 두근을 잡습니다. 6 센티미터 접시에 근육을 넣으십시오. 햄스트링과 대퇴골 주변의 남은 근육을 분리하여 접시로 옮깁니다.
얼음 위에 보관 된 접시에 뒷다리 근육을 모으십시오. 접시에서 세척 매체를 흡입하고 근육을 촉촉하게 유지하기 위해 1-2 밀리리터의 근육 해리 완충액을 첨가하십시오. 다음으로, 근육을 철저히 다진다 메스를 사용하여 근육을 찢고 자른 다음 가위를 사용하여 잘 다진 조직의 슬러리 페이스트를 얻을 때까지 1-2 분 동안 근육을 작은 조각으로 자릅니다.
그런 다음 다진 근육을 근육 해리 버퍼가 들어있는 원추형 튜브로 옮깁니다. 실험실 필름으로 튜브를 밀봉하고 섭씨 37도 수조에서 1 시간 동안 교반하면서 배양합니다. 1 시간 후 셰이커에서 튜브를 제거하고 세척 매체로 50 밀리리터로 채우고 튜브를 부드럽게 두 번 뒤집어 혼합되도록합니다.
스윙 버킷 로터의 셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 250배 G로 원심분리합니다. 42 밀리리터의 상청액을 두 개의 새로운 튜브로 옮기고 원래 튜브에 8 밀리리터를 남겨 둡니다. 21 밀리리터의 상청액을 포함하는 새 튜브를 세척 매체로 최대 50 밀리리터까지 채 웁니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 8 분 동안 350 배 G에서 세포를 원심 분리합니다. 상청액을 흡입하고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 8 밀리리터의 근육 해리 완충액을 포함하는 원래 튜브에 1 밀리리터의 콜라겐 분해 효소 2 스톡과 1 밀리리터의 dis 기반 스톡을 추가합니다.
5 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 막힘없이 펠렛을 10 회 재현탁하십시오. 형성 기포를 피하면서 튜브의 벽을 향해 용액을 배출하십시오. 실험실 필름으로 튜브를 밀봉하고 섭씨 37 도의 수조에서 30 분 동안 교반하면서 배양합니다.
30 분 후, 셰이커 흡인물에서 튜브를 제거하고 20 게이지 바늘로 10 밀리리터 주사기를 통해 근육 현탁액을 10 회 배출하고 세척 매체로 각 튜브를 최대 50 밀리리터까지 채우고 튜브를 뒤집습니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5 분 동안 250 배 G에서 원심 분리하고 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 원래 튜브에 8 밀리리터를 남깁니다.
새 튜브를 세척 매체로 최대 50 밀리리터까지 채우고 섭씨 4도에서 8 분 동안 350 배 G로 세포를 다시 원심 분리합니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 8 밀리리터의 세척 매체가 들어있는 원래의 50 밀리리터 원추형 튜브에 40 미크론 나일론 셀 스트레이너를 놓고 1-2 밀리리터의 세척 매체로 스트레이너를 미리 적시십시오.
스트레이너를 잡고 있는 동안 10밀리리터 피펫을 사용하여 펠릿을 부드럽게 다시 부유시킵니다. 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 동일한 튜브로 다시 여과하여 세포 손실을 최소화합니다. 각 튜브에 4-5 밀리리터의 세척 매체를 추가하여 다른 튜브 펠릿을 원래 튜브로 다시 필터링하여 펠릿을 다시 부유시키고 용액을 원래 튜브에 위치한 자체 스트레이너로 옮깁니다.
모든 펠릿을 원래의 50 밀리리터 튜브에 모은 후 다른 4-5 밀리리터의 세척 매체로 자체 여과기를 헹굽니다. 1000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 자체 여과기 밑면에서 모든 액체를 수집합니다. 각 튜브에 최대 50ml의 세척 매체를 채우고 튜브를 뒤집습니다.
튜브를 섭씨 4도에서 5 분 동안 250 배 G로 원심 분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 즉시 상청액을 제거하고 600 마이크로리터의 세척 매체에 펠릿을 재현탁시킨다. 현탁액을 2 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
항체 CD 31 APC CD 45 APC SCA 1 퍼시픽 블루 VCAM 원 비오틴 및 알파세븐 인테그린 PE를 세포 현탁액을 함유하는 2 밀리미터 튜브에 첨가한다. 세포를 섭씨 4도의 회전 셰이커에서 45분 동안 부드럽게 혼합하고 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 배양 후, 세척 매체로 최대 2 밀리리터까지 모든 튜브를 채우고 섭씨 4도에서 5 분 동안 250 배 G로 원심 분리합니다.
상청액을 제거하고 펠릿을 300 마이크로리터의 세척 배지에 재현탁시킨다. 다음으로, 스트렙타비딘 항체를 튜브에 넣고 섭씨 4도의 회전 셰이커에서 세포를 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 스트렙타비딘 항체가 들어있는 튜브를 세척 배지로 2 밀리리터로 채 웁니다.
그런 다음 튜브를 원심 분리하고 상청액을 완전히 흡인하십시오. 2차 세척 후, 세포를 500 마이크로리터의 세척 배지에 실험 튜브 내에 재현탁시킨다. 5 밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브의 셀 스트레이너 캡을 200 마이크로 리터의 세척 매체로 미리 적시십시오.
실험 튜브에서 5 밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 중력에 의해 여과되도록합니다. 실험 샘플 현탁액을 포함하는 2 밀리리터 튜브를 300 마이크로 리터의 세척 매체로 인쇄하고 동일한 스트레이너 캡을 통과시킵니다. 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 세포 여과기 아래쪽에서 모든 액체를 수집합니다.
뚜껑으로 밀봉하고 튜브를 얼음 위에 놓고 빛으로부터 보호하십시오. 섬유 지방 생성 전구 세포와 근육 줄기 세포의 분리를 위해 채택 된 게이팅 전략이 여기에 나와 있습니다. 리포터 마우스에서 PD GFR 알파 EGF P 노크는 내인성 PD G FFR 알파 유전자좌로부터 H2 B E G F P 융합 유전자를 발현하여, PD G GFR 알파 계통의 효율적이고 특이적인 표지를 가능하게 한다.
분리된 세포 집단의 순도는 PAC-7 항체를 사용한 GFP 양성 섬유 지방형성 전구세포 및 근육 줄기세포의 공동 배양 면역 염색에 의해 확인되었다. GFP 양성 섬유 지방형성 전구체는 PAC-7 마커를 발현하지 않는 반면, 근육 줄기 세포는 이 항체와 반응했습니다. 모든 GFP 발현 세포는 SCA 1에 대해 양성이었고 CD 31에 대해 음성이었고, CD45는 VCAM 1 및 알파세븐 인테그린에 대해 음성이었다.
손상 후 7일 후 독소가 없는 근육내 주사로 손상된 마우스로부터 분리된 섬유무지방형성 전구세포 및 근육 줄기 세포를 나타내었다. 근육 줄기 세포가 활성화됨에 따라 세포 크기가 증가합니다. F SCA 및 SS CA 매개 변수를 조정하고 중앙에 해당 셀을 포함하도록 게이트를 확장하는 것이 중요합니다.
손상되지 않은 및 손상 후 7일째 TA 근육에서 섬유 지방형성 전구세포 및 근육 줄기 세포의 정량화가 여기에 표시됩니다. 2일과 3일 사이에 피크와 증식이 관찰되었지만, 손상 7일 후에도 여전히 낮은 세포 증식률이 눈에 띄었다. 적절한 근육 분쇄를 수행하는 것은 단일 세포를 방출하는 데 매우 중요합니다.
또한, 모노뉴클레오티드 세포 분리는 20 게이지 바늘로 현탁액을 10 밀리리터 주사기로 실행하여 달성됩니다. 이 기술은 과학자들이 정상 상태와 근육 재생의 더 깊은 단계에서 Forbes 및 근육 줄기 세포의 생물학적 전사 및 후성 유전체 프로필을 연구하는 데 도움이 될 것입니다.
