저자는 여기에 제시 된 프로토콜의 준비의 모든 단계를 통해 유익한 토론을위한 전체 ACEnano 컨소시엄에 감사드립니다. 저자는 또한 ACEnano 프로젝트의 프레임에 보조금 계약 nº 720952에 따라 유럽 연합 호라이즌 2020 프로그램 (H2020)에서 자금을 주셔서 감사합니다.

1. AF4 시스템 설정
<ol><li>AF4 카트리지를 조립하고 제조업체 매뉴얼에 제공된 지침에 따라 AF4 시스템과 UV-vis 검출기(재료테이블)의모든 하드웨어 구성 요소를 연결합니다.</li>
	<li>제조업체 매뉴얼에 제공된 지침에 따라 제어, 데이터 수집, 처리 및 평가를 위해 필요한 모든 소프트웨어 패키지를 설치합니다.</li>
	<li>AF4 시스템과 UV-vis 검출기 간의 필요한 모든 신호 연결이 확립되었는지 확인합니다.</li>
	<li>15분 동안 초순수(UPW)로 설정을 플러시하여 기존 AF4-UV-vis 연결이 단단하고 누수 없이 있는지 확인하십시오(팁 유량 1mL(@min-1),초점 유량 1mL(@min-1),교차 유량 1.5mL(@min-1). 이렇게 하려면 AF4 제어 소프트웨어를 열고 방문 페이지의 오른쪽 상단에 있는 각 패널에 유량체를 입력합니다. 필요한 경우 각 커넥터(피팅)를 조이고 누출이 관찰되지 않으면 절차를 반복합니다. 참고: 모든 측정 중 내부 시스템 압력을 모니터링해야 하며 4~12bar 이내여야 합니다. 압력이 높거나 낮을 경우, 압력 튜브를 조정해야합니다. 또한 전체 측정 시간에 걸쳐 채널 압력 추세가 일정해야 합니다. 참고: 채널 오븐을 사용할 수 있는 경우 온도를 25°C로 설정하여 모든 AF4 실험에서 유사한 측정 조건을 보장합니다.</li>
</ol>2. AF4-UV-vis 시스템 자격 및 샘플 분석을 위한 솔루션 및 서스펜션 준비
<ol><li>청소 솔루션<ol>
<li>수산화나트륨 8g과 도데킬 황산나트륨 2g을 UPW 1L에 넣고 총 용해될 때까지 용액을 저어줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>용인성<ol>
<li>여과된 계면활성제 혼합물 500μL을 여과 및 탈가UPW 2L에 추가하여 용출(0.025%(v/v), pH 약 9.4)를 얻습니다. 참고: 계면활성제 혼합물의 화합물에 대한 자세한 설명은 표 1(또한 재료 표)에제공됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>질량 복구 측정을 위한 임의 AuNP 크기 표준<ol>
<li>소용돌이 임의 AuNP 크기 표준 (50 mg∙L-1)2 분 동안 그것을 희석 1:4 UPW와 함께 12.5 mg∙L-1의최종 질량 농도를 얻을 수 있습니다. 희석 후 추가 2분 동안 소용돌이가 얻어진 서스펜션을 균질화한다. 주의: 화학 물질, 특히 NaOH 펠릿으로 작업할 때 필요한 예방 조치와 적절한 보호 장비가 필요합니다. 참고: 일반적으로 AF4-UV-vis 실험 중 낮은 입자 배경을 보장하기 위해 0.1 μm 멤브레인 필터(친수성 PVDF 또는 이와 유사한)를 사용하여 필요한 모든 솔루션(세척 용액 제외)을 탈가스 및 필터링하는 것이 좋습니다. 전용 진공 여과 장치 또는 주사기 필터를 사용하여 이를 만들 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AF4-UV-vis 시스템 자격
<ol><li>1.4단계에서 설명된 소프트웨어 설정을 사용하여 30분 동안 세척 용액으로 시스템을 플러시합니다(팁 유량 1mL(@min-1),초점 유량 1mL(@min-1,교차 유량 1.5mL+min-1).</li>
	<li>각각의 용액 병을 변경하고 UPW로 시스템을 20분 동안 플러시합니다(팁 유량 1mL(@min-1),초점 유량 1mL(@min-1,크로스 유량 1.5mL+min-1).</li>
	<li>각각의 인라인 펌프 필터를 교체합니다.</li>
	<li>AF4 카트리지를 열고 AF4 멤브레인을 교체합니다. AF4 카트리지를 다시 조립하고 AF4-UV-vis 시스템과 다시 연결합니다.</li>
	<li>멤브레인을 평형화하고 시스템을 안정화하기 위해 청소된 AF4-UV-vis 시스템을 최소 30분 동안 용액으로 플러시하여 시스템을 안정화시킵니다(팁 유량 1mL(@min-1,초점 유량 1mL(@min-1,및 크로스 유량 1.5mL+min-1). 잠재적인 누출을 다시 확인합니다(1.4단계 참조).</li>
	<li>임의AuNP 크기 표준을 사용하여 대량 회수 및 보존 시간의 변동을 결정하여 AF4-UV-vis 시스템을 검증합니다.<ol>
<li>분리력을 적용하지 않고 직접 사출 실행을 수행합니다.<ol>
<li>파일을 열어 새 측정 파일 만들기 | 새로운 | AF4 제어 소프트웨어에서 실행합니다.</li>
			<li>실행 탭 내에서 샘플 및 측정 설명과 사출 볼륨 및 샘플 이름을 정의합니다. 측정 조건은 표 2에표시됩니다.</li>
			<li>표 2에따라 두 번째 탭 FFF 메서드에서 측정 매개 변수를 설정합니다.</li>
			<li>실행 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>분리력(크로스 흐름)을 적용하여 분획 실행을 수행합니다.<ol>
<li>표 3에 지정된 분수 조건을 사용하여 이전 섹션에 설명된 대로 분수 메서드를 정의합니다.</li>
			<li>실행 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다.</li>
			<li>네 배에서 측정을 수행합니다. 참고: 첫 번째 실행은 시스템(즉, AF4 멤브레인)을 컨디셔닝하는 것을 목표로 하며 시스템 자격 결과의 최종 평가에서 제외됩니다. 참고: 파일을 열어 생성된 모든 실행 파일을 저장하는 것이 좋습니다| AF4 제어 소프트웨어에 저장합니다. </li>
			<li>AF4-UV-vis-system은 임의AuNP 크기 표준에 대해 >80%의 대량 회수 및 보유 시간 및 2%의 변형을 얻을 경우 자격을 갖춘 것으로 간주합니다.</li>
			<li>자동 샘플러를 사출 시스템으로 사용하는 경우, 최적의 주행 조건을 보장하기 위해 AF4-UV-vis 시스템(예: 청소 용액, UPW 또는 각각용염)을 통해 펌핑되는 동일한 솔루션으로 자동 샘플러의 바늘 세척 저수지 병을 채웁니다. 용광을 변경할 때, 일반적으로 기준선이 일정한 수준에서 안정적으로 유지될 때까지 UV-vis-detector 신호를 모니터링하여 AF4 시스템의 재평을 따르는 것이 좋습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. AF4-UV-vis 샘플 분석
<ol><li>각각의 AuNP 서스펜션(20nm, 40nm, 80nm, 100nm, 각 50 mg)을 소용돌이시켜 외부 크기 교정을 위한 모든 AuNP 크기 표준을 준비한다. L-1)2 분 동안 12.5 mg의 mg∙L-1의최종 질량 농도를 얻기 위해 UPW로 1:4를 희석한다. 희석 후 추가 2분 동안 소용돌이가 얻어진 서스펜션을 균질화한다.</li>
	<li>4.1 단계에서 설명된 교정 표준과 동일한 절차를 적용하는 분석을 위해 알 수 없는 AuNP 샘플을 준비한다.</li>
	<li>표 2에표시된 AF4 방법을 사용하여 모든 AuNP 크기 표준의 직접 사출 측정을 수행한다.<ol>
<li>이렇게 하려면 표 2에 요약된 각 값을 적절한 위치에서 제조업체의 소프트웨어에 입력하여 분리 및 샘플 매개 변수를 정의하고 실행 버튼을 눌러 실험을 시작합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표 3에 표시된 AF4 방법을 사용하여 각 AuNP 크기 표준을 개별적으로 분수하여 외부 크기 교정 기능을 설정합니다.<ol>
<li>표 3에 요약된 각 값을 적절한 위치에서 제조업체의 소프트웨어에 입력합니다. 분획 방법은 초점 단계, 여러 용출 단계 및 헹도 단계에 의해 정의됩니다. 메서드를 설정한 후 실행 버튼을 눌러 실험을 시작합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표 2에표시된 AF4 방법을 사용하여 알 수 없는 AuNP 샘플의 직접 사출 측정을 수행한다.</li>
	<li>표 3에나열된 AF4 방법을 수행하여 알 수 없는 AuNP 샘플의 분획을 수행한다.</li>
	<li>의미 있고 통계적으로 관련된 결과를 보장하기 위해 달리 명시되지 않는 한 3항과 4항에 언급된 모든 측정을 삼중측정을 수행합니다.<ol>
<li>저장 50 mg∙L-1 AuNP 재고 현탁액을 사용하기 전에 4-8°C에 보관하십시오. 희석 된 AuNP 서스펜션은 신청 30 분 이내에 이상적으로 준비됩니다. 참고 : 소용돌이는 일반적으로 충분하며 서스펜션의 초음파가 필요하지 않습니다.</li>
		<li>AuNP 크기 표준에 대해 얻어진 보존 시간과 알 수 없는 AuNP 샘플의 보존 시간의 상관관계를 가능하게 하기 위해 동일한 AF4 방법을 사용하여 모든 샘플을 측정합니다. 참고: 일정하고 유효한 분리 조건을 보장하기 위해 정의된 수의 샘플 측정(예: 10측정)이 지나면 시스템 자격 섹션에 설명된 분수 단계를 포함/반복합니다( 예: 10측정). 또한 시스템 압력 및 UV-vis 검출기 기준선 안정성을 기록합니다. 그들은 완전한 AF4-UV-vis 실행을 따라 안정적이고 일정하게 유지해야합니다. 참고: 일반적으로 UV-vis 검출기(또는 다중 각도 광 산란(MALS) 검출기(또는 사용 가능한 경우)가 복구, 시료 피크 형상 또는 반복성(또는 AF4-UV-vis-system)과 같은 향상된 노이즈 레벨 또는 정의된 시스템 자격 기준을 표시할 때 초여침 멤브레인을 교체한다(또는 AF4-UV-vis-system은 철저한 세척 절차를 거쳤다). 여기에 설명된 조건하에서, 자격을 갖춘 AF4-UV-vis 시스템은 일반적으로 동일한 멤브레인을 사용하여 적어도 50개의 측정에 대해 안정적입니다. 그러나, 정의된 품질 기준을 충족하는 가능한 연속 측정 횟수는 시료, 샘플 매트릭스 및 용액 조성에 따라 크게 달라질 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 데이터 평가
<ol><li>제조업체 매뉴얼에 제공된 지침에 따라 각 데이터 수집 소프트웨어에서 필요한 모든 원시 데이터(즉, UV-vis 피크 영역)를 내보낸 후 AF4-UV-vis 시스템 제조업체에서 제공하는 데이터 평가 소프트웨어 또는 스프레드시트 분석을 사용하여 대량 복구 계산을 수행합니다.<ol>
<li>다음 방정식을 사용하여 분획 측정(A분별)및 직접 주입 측정(A직접 주입)의각각UV-vis 피크 아래 영역을 비교하여 AuNP 질량 회수를 계산합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> 참고: 직접 주입 측정 중에 분리 력이 적용되지 않으므로 축적 벽이있는 해석 종의 잠재적 상호 작용을 무시할 수 있습니다. 각각의 UV-vis 피크 아래 영역은 샘플 내의 다른 종들이 분획 조건 ii하에서 다른 보존 시간에 흡수되지 않는다고 가정하여 맥주-램버트 법을 사용하여 AuNP 질량과 직접 상관관계가 있을 수 있다.</li>
		<li>직접 주입 및 분별 실행 모두에서 얻은 dat. 파일을 가져옵니다.</li>
		<li>개요 탭에서 UV-vis 검출기 추적을 선택합니다.</li>
		<li>모든 측정에 대한 신호 및 기준보기에서 관심 영역(ROI)과 기준선을 정의합니다.</li>
		<li>삽입을 통해 직접 사출 교정을 삽입합니다. </li>
		<li>직접 사출 교정 설정 보기에서 모든 직접 사출 실행을 선택하고 UV 소멸 계수를 입력합니다. 참고: 교정 및 분획 측정 모두에 동일한 UV-vis 소멸 계수를 사용하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>ROVI 내의 UV-vis 신호 추적 하에 있는 영역을 이용하여 교정 라인을 설정하고 입력된 농도 및 사출 부피로부터 계산된 주입량을 설정한다. 획득된 교정은 별도의 직접 사출 교정 기능 창에 표시됩니다.</li>
		<li>교정 함수를 각 분획 측정에 할당합니다. 참고: 각 교정 크기 표준 및 알 수 없는 AuNP 샘플에 대해 AuNP의 크기에 종속된 UV-vis 흡광도로 인해 별도의 교정 기능을 수립해야 합니다. UV-vis 검출기의 이러한 단점은 ICP-MS와 같은 질량 감지기를 사용하여 회피할 수 있습니다.</li>
		<li>정량적 결과 계산을 삽입하여 분석을 수행하고 결과는 농도 및 주입 된 양 값으로 오른쪽 테이블 내에 표시됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>제조업체 매뉴얼에 명시된 지침에 따라 각 데이터 수집 소프트웨어에서 필요한 모든 원시 데이터(즉, 각각 UV-vis 피크 최대량 및 각 보이드 시간)의 내보내기 후 AF4 시스템 제조업체 또는 스프레드시트 분석에서 제공하는 데이터 평가 소프트웨어 또는 스프레드시트 분석을 사용하여 보존 시간의 변동을 계산합니다.<ol>
<li>개요 창을 열어 가져온 모든 측정값에 대해 각각의 UV 추적을 표시합니다.</li>
		<li>피크 감지는 자동으로 수행됩니다. 신호 처리 도구 상자 내에서 피크 검출 매개 변수를 조정하여 성능을 최적화합니다. 모든 측정 파일을 통과하여 각각의 피크 최대값을 추출합니다.</li>
		<li>다음 방정식을 사용하여 모든 측정에 대한 상대표준 편차를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> 계산은 각각의 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 수행할 수도 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>제조업체 매뉴얼에 제공된 지침에 따라 각 데이터 수집 소프트웨어에서 필요한 모든 원시 데이터(UV-vis 피크 최대 분석 및 각 보이드 시간)를 내보낸 후 제조업체또는 스프레드시트 분석에서 제공하는 데이터 평가 소프트웨어를 사용하여 크기 측정을 수행합니다. 외부 크기 교정 기능은 이전에 수행된 DLS 측정에서 얻은 유체역학적 크기에 대해 AuNP 크기 표준(20nm, 40nm, 80nm, 100nm)의 보이드 시간 수정 된 보존 시간(순 보존 시간, 표 5참조)을 플로팅하여 확립될 수 있다(표 4참조). 참고: DLS 측정은 유사한 샘플 특성을 보장하기 위해 각각의 분획 측정과 동일한 날에 이상적으로 수행되어야 합니다.<ol>
<li>.dat 파일을 가져온 후 모든 측정값이 개요 탭에 표시됩니다. 오버레이 창 아래에 표시되는 검출기 목록에서 UV-vis 검출기 신호를 선택합니다. 신호 및 기준선 뷰에서 조정할 수 있는 각 측정에 대해 ROI 및 기준선을 정의합니다. 오른쪽의 신호 처리 도구 상자를 사용하여 시끄러운 신호를 부드럽게 합니다. 다른 실행 함수에 할당 처리 매개 변수를 사용하여 매개 변수를 각각 다른 측정에 할당할 수 있습니다.</li>
		<li>삽입 탭에서 파티클 크기 보정을 선택합니다.</li>
		<li>오른쪽 상단의 교정 테이블에 대한 참조 선택에서 각 측정값을 클릭하여 모든 교정 실행을 선택합니다. 선택한 모든 측정값은 아래 표에 표시됩니다. 표 4에지정된 모든 교정 측정에 대한 유체 역학 반지름을 입력합니다. 함수는 파티클 크기 보정에 표시됩니다 – 함수 창과 방정식도 표시됩니다. 참고: 설정된 크기 교정함수의 상관 계수(R2)는 ≥0.990이어야 한다.</li>
		<li>할당에 대한 실행 선택 목록 내에서 각각의 분획을 선택하여 알 수 없는 AuNP 샘플의 측정에 교정 함수를 할당합니다.</li>
		<li>삽입 탭 내에서 파티클 크기 분포 계산을 열어 결과를 표시합니다. 이전에 생성된 파티클 크기 보정은 오른쪽 창 설정에표시되는 알 수 없는 AuNP 샘플 측정에 대한 교정으로 나열됩니다. 계산된 크기는 최대값으로 레이블이 지정된 크기 분포 창에 표시됩니다. 샘플 확인란의 평균 신호를 선택하여 한 샘플의 모든 측정값을 평균화하고 결과를 최대 최대 레이블로 나열합니다.</li>
		<li>또한 교정 곡선 확인란 표시를 선택하여 교정 선을 프랙토그램 위에 플롯합니다. 누적 크기 분포는 누적 배포 확인란 표시를 선택하여 사용할 수 있습니다. 참고: 데이터 평가를 위해 제조업체의 소프트웨어를 사용하는 경우 삽입 탭 내부의 보고서를 클릭하여 생성할 수 있는 모든 결과를 보고서에 추가하는 것이 좋습니다. 보고서 단추는 모든 결과, 테이블 및 다이어그램을 문서에 추가합니다. 보고서 탭에서 문서 섹션 내에서 보고서 설정을 열어 보고서 설정을 변경할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

이 원고의 모든 저자는 이 프로토콜에 제품이 활용되는 Postnova Analytics GmbH의 직원입니다.

알 수 없는 AuNP의 유체 역학 크기는 20nm에서 100nm에 이르는 잘 정의된 AuNP 크기 표준을 사용하여 UV-vis 검출기와 결합된 AF4에 의해 정확하게 평가되었습니다. 개발된 AF4 방법은 측정된 보존 시간과 AuNP 크기 사이의 선형 관계를 확립하기 위해 일정한 교차 흐름 프로파일을 사용하여 최적화되어 선형 회귀 분석에서 간단한 크기 측정을 가능하게 했습니다. 특히 분획 시 상당한 시료 손실을 나타내는 충분히 높은 회수율을 달성하는 데 중점을 두었으며, 적용된 용염 및 멤브레인을 포함한 개발된 AF4 방법이 모든 분획된 AuNP 샘플과 잘 일치한다는 점도 있었다.
방법 개발은 틀림없이 AF4및 채널 치수, 흐름 매개 변수뿐만 아니라 용출, 멤브레인, 스페이서 높이, 심지어 샘플 속성을 포함한 여러 매개 변수에서 가장 중요한 단계입니다 주어진 용출 시간 기간 내에서 분획을 개선하기 위해 고려해야합니다. 이 단락의 목적은 여기에서 설명한 알 수 없는 AuNP 샘플의 크기를 성공적으로 결정하기 위해 최적화된 중요한 단계를 독자를 안내하는 것입니다. 일반적으로 AF4 방법을 개발하는 방법에 대한 보다 상세한 설명을 위해, 독자는 'ISO/TS21362:2018 - 나노기술- 비대칭 유동 및 원심 필드 흐름 분획을사용하여 나노 물체의 분석'의 AF4 섹션을 지칭한다. 표 3에주어진 적용된 분획 조건을 자세히 살펴보면, 첫 번째 중요한 단계는 AF4 채널에서 AuNP 샘플의 도입 및 이완입니다. 이 단계는 사출 흐름, 초점 흐름 및 교차 흐름에 의해 제어되며, 그 상호 작용은 샘플을 멤브레인 표면에 가깝게 배치하고 기본적으로 분획의 시작점을 정의하는 AF4 채널의 주입 포트 근처의 좁은 대역에 집중하도록 강요합니다. 이 단계에서와 같이 시료의 충분한 이완이 필수적이며, 다양한 크기의 샘플 성분은 AF4 채널의 다른 높이에서 찾아성공적인 크기 분획의 기초를 제공한다. 불완전한 견본 이완은 일반적으로 유지되지 않은 (즉, 비 이완) 샘플 성분으로 인한 증가 된 공허 피크 영역에 의해 볼 수 있습니다. 이 효과는 주입 시간 및/또는 적용된 교차 유량을 증가시킴으로써 완화될 수 있다. 그러나 두 매개 변수 모두 신중하게 최적화해야 하며, 특히 AF4 멤브레인에 대한 응집 및 흡착되기 쉬운 시료에 대해 서로 다른 파라미터설정(36,37)에대해 얻어진 각각의 회수율에 의해 모니터링될 수 있다. 1.0mL+min-1의 교차 유량과 함께 5분의 적용된 주입 시간은 모든 AuNP 샘플에 대한 회수율 >80%와 거의 최적의 휴식 조건을 나타내는 무시할 수 있는 보이드 피크 영역을 나타냈습니다. AuNP 샘플의 충분한 이완 후, 각 UV-vis 검출기로의 AF4 채널 길이를 따라 초점 흐름이 중지되고 샘플 전송이 두 번째 임계 단계를 나타내기 시작했다. 합리적인 분석 시간에 충분히 높은 분획 전력을 보장하기 위해, 30-50 분 당 1.0mL(@min-1)의 일정한 교차 유량 (각각분획 된 AuNP 크기 표준에 따라 다름)이 적용되었고, 0.5 mL.min-1의 검출기 유량에서 10 분 선형 교차 유량 붕괴가 적용되었습니다. 모든 AuNP 크기 표준의 분리에 걸쳐 일정한 교차 흐름 프로파일을 사용하여 FFF-theory22에이어 보존 시간과 AuNP 크기 사이의 선형 관계를 밝혀, 따라서 간단한 선형 회귀 분석에 의해 알 수없는 AuNP 샘플의 크기 측정을 가능하게한다. 그러나, 일정한 교차 흐름 이외의 프로파일은 나노 입자의 크기 조정을 위해 악용되어 궁극적으로 보존 시간과 입자 크기38, 39사이의 비선형 관계로 이어진다. 또한, 잘 정의된 크기 표준을 사용하는 AF4의 크기 측정은 AuNP에 국한되지 않고 다른 크기 및 원소 조성(예를 들어, 은38,40 또는 실리카 나노입자41,42)을가진 나노입자에도 적용될 수 있다. 또한 희석 시료로 작업할 때 ICP-MS는 매우 민감한 원소 검출기로 AF4와 결합될 수 있으며, 현탁액에서 다양한 나노입자를 크기 조정하기 위한 이 분석 접근법의 다기능성을 더합니다.
광범위한 적용에도 불구하고 AF4의 잘 정의된 크기 표준을 사용하는 외부 크기 교정에는 알 수 없는 샘플의 정확한 크기 조정을 위해 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 특성이 있습니다. 우선, 각각의 크기 표준과 실제 샘플의 분획 중에 유사한 조건의 적용에 크게 의존한다. 여기에 제시된 경우, 따라서 AuNP 크기 표준과 알려지지 않은 AuNP 샘플모두 동일한 AF4 방법뿐만 아니라 동일한 용염 및 동일한 멤브레인을 사용하여 분획되어 이 접근법을 매우 유연하게 렌더링하는 것이 필수적입니다. 더욱이, 크기에 민감한 검출기가 없는 경우, 예를 들어, 빛 산란(MALS 및 DLS)을 손에 들고, 크기 표준을 사용하는 각 AF4 방법이 충분히 잘 작동하는지 여부를 결정하기 어렵다. 이것은 특히 모든 샘플 성분이 정상적인 용용 패턴을 따르는지 여부가 불분명하게 남아 있는 알 수 없는 샘플에 대해 마찬가지입니다: 더 작은 입자에서 더 큰 입자로분획, 또는 더 큰 샘플 성분이 이미 스테릭 하이퍼레이어 모드에서 elute여부를 수행하여 더 작은 샘플 성분43,44와잠재적으로 동조할 수 있습니다. 또한, FFF 이론은 AF4가환경과의상호 작용 없이 포인트 질량으로 간주되는 입자와 유체 역학적 크기의 차이에 기초하여 단독으로 분리된다는 것을 강조하지만, 현실은 입자 입자 및 입자 막 상호 작용(예: 정전기 어트랙션/반발 또는 반-데르-왈스 어트랙션)과 다른 이야기를 들려주며, 46개의 외부 측정을 통해 상당한 역할을 할 수 있으며, 잠재적으로46개의외부 측정을 통해 측정 가능한 크기 측정을 도입할 수 있다. 따라서 관심 있는 입자(40) 및 표면 특성(Zeta potential)과 이상적으로 일치하는 크기 표준을 사용하는 것이좋습니다(40) 또는, 이들이 사용할 수 없는 경우, 적어도 잘 특징적인 입자 크기 표준(예를 들어, 폴리스티렌 라텍스 입자)을사용하고,특히 47의 잠재적인 분석에서 관심 있는 입자와의 비교가능성을 신중하게 평가하는 것이좋습니다.
AF4의 다재다능함은 종종 가장 큰 강점으로 간주됩니다, 그것은이 분야에서 대부분의 일반적인 크기 조정 기술을 넘어 응용 범위를 제공으로22,48,49. 동시에, 그 관련 된 아마도 복잡성으로 인해, 그것은 또한 특히 DLS와 같은 빠르고 표면적으로 사용하기 쉬운 크기 조정 기술에 대 한 그것의 가장 중요 한 단점으로 간주 될 수 있습니다., 나노 입자 추적 분석, 또는 단일 입자 ICP-MS. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 인기 있는 크기 조정 기법으로 관점에 AF4를 넣어 때, 그것은 분명 하 게 모든 기술 그들의 장 단점, 하지만 그들 모두는 나노 입자의 physico-화학 적 특성의 보다 포괄적인 이해에 기여 하 고 따라서 경쟁 보다는 보완 으로 간주 되어야 한다.
여기에 제시된 표준 운영 절차(SOP)는, 서스펜션에서 알 수 없는 AuNP 샘플의 크기 조정을 위한 외부 크기 보정을 갖춘 AF4-UV-vis의 우수한 적용성을 강조하고, 결국 호라이즌 2020 프로젝트의 프레임에서 수행된 국제 간 실험실 비교(ILC) 내에서 알 수 없는 AuNP 샘플의 AF4 분석을 위한 권장 지침으로 적용되었다. 따라서 이 프로토콜은 AF4 방법론25,50,51,52가 나노입자 특성화 분야에서 AF4의 유망한 잠재력을 강조하고 검증하고 표준화하기 위한 격려적이고 지속적인 국제적 노력을 추가합니다.

콜로이드 금 형태의 금 나노 입자 (AuNP)는 나노 입자가 무엇인지 에 대한 이해가 있기 오래 전에 인간 문화의 일부였으며 나노 입자라는 용어가 현대적이고 과학적인 어휘로 들어가는 것을 발견했습니다. 그들의 나노 규모 외관에 대한 뚜렷한 지식없이, 중단 AuNP는 이미 V-VI 세기 기원전1에서고대 중국, 아라비아, 인도에서 의료 및 기타 목적을 위해 사용되었으며, 또한 고대 로마인들은 대영 박물관2에서리커거스 컵 전시회에서 도자기를 얼룩지게하기 위해 루비 붉은 색을 이용했습니다. 서구 세계에서, 현대 시대에 중세시대까지 수세기 동안, AuNP는 주로 유리와 에나멜 (카시우스의 보라색) 3색광제로서 사용되었을 뿐만 아니라 다양한 질병(Potable Gold), 특히 매독4를치료하기 위해 사용되었다.
그러나, 이러한 모든 연구는 주로 일시 중단 AuNP의 응용 프로그램에 초점을 맞춘 했다 그리고 그것은 그들의 형성을 조사 하는 첫 번째 합리적인 접근 방식을 소개 하는 1857 년에 마이클 패라데이까지 했다, 그들의 특성 뿐만 아니라 그들의 속성5. 패라데이는 이러한 AuNP가 매우 미세한 치수를 가져야한다는 것을 이미 알고 있었지만, 크기 분포에 대한 명시적 정보에 액세스 할 때 전자 현미경 검사가 개발될때까지는 6,7,결국 크기와 다른 AuNP 속성 사이의 상관 관계를 가능하게했습니다.
요즘, 그들의 매우 쉽고 간단한 합성 덕분에, 놀라운 광학 특성 (표면 플라스몬 공명), 좋은 화학 적 안정성과 따라서 사소한 독성뿐만 아니라 사용 가능한 크기와 표면 수정의 측면에서 자신의 높은 다기능성, AuNP는 나노 전자8,진단9,암 치료10,또는 약물 전달11등의 분야에서 광범위한 응용 프로그램을 발견했다. 이러한 응용 분야에서 적용된 AuNP의 크기와 크기 분포에 대한 정확한 지식은 최적의효능(12)을 보장하기 위한 기본 전제 조건이며 이 중요한 물리 화학 파라미터를 결정하기 위한 견고하고 신뢰할 수 있는 도구에 대한 상당한 수요가 있습니다. 오늘날, AuNP를 현탁액으로 조정할 수 있는 분석 기술이 많고, 예를 들어, UV-vis 분광기(UV-vis)(13),동적 광 산란(DLS)14 또는 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분광법(spICP-MS)15 필드-유량 분별(FFF)이 이 분야의 핵심 플레이어인16,17,18,19,20.
1966년 J. Calvin Giddings21에의해 처음 개념화된 FFF는 고정단계22,23이없는 얇고 리본같은 채널 내에서 분리가 이루어지는 용출 기반 분획 기술의 제품군으로 구성된다. FFF에서, 분리는 샘플이 일반적으로 각각의 인라인 검출기로 하류로 이송되는 라미나르 채널 흐름의 방향에 수직으로 작용하는 외부 힘 필드와의 샘플의 상호 작용에 의해 유도된다. 이러한 관련 FFF-기술 중, 두 번째 흐름(cross flow)이 포스 필드역할을 하는 비대칭 유동 필드-흐름 분획(AF4)은 가장 널리 사용되는 하위유형(24)이되었다. AF4에서, 채널 바닥(축적 벽)에는 시료를 유지하면서 동시에 교차 흐름이 멤브레인을 통과하고 추가 콘센트를 통해 채널을 떠날 수 있는 반응과성 초여과 멤브레인이 장착되어 있습니다. 이를 통해, 교차 흐름은 시료를 축적 벽쪽으로 밀어 확산 유도플럭스(Brownian motion)에 대응할 수 있다. 필드 및 확산 유도 플럭스의 결과 평형에서; 더 높은 확산 계수를 나타내는 작은 샘플 성분은 채널 센터에 더 가깝게 정렬되며 더 큰 샘플 성분은 낮은 확산 계수를 나타내는 축적 벽에 더 가깝게 위치합니다. 따라서 채널 내부의 포물선 흐름 프로파일로 인해 더 작은 샘플 성분은 더 큰 샘플 성분보다 앞서 채널 흐름의 빠른 라미네로 이송됩니다. FFF 보존 파라미터및 스토크스-아인슈타인 확산 계수 방정식을 사용하여, 용출 시간 및 각각 용출 부피, AF4 샘플의 유체역학 적 크기22로직접 변환될 수 있다. 여기서 설명된 용출 거동은 정상 용출 모드를 말하며 일반적으로 약 1-500 nm(입자 특성 및 분획 파라미터에 따라 2000nm까지) 사이의 입자 크기 범위 내에서 AF4에 유효하지만 steric-hyperlayer 용출은 일반적으로 이 크기 임계값25이상으로 발생합니다.
FFF에 의해 분리 된 후 크기 정보를 파생하는 세 가지 일반적인 방법이 있습니다. FFF는 모듈식 기기이기 때문에, 다각광 산란(MALS)26,27,다이나믹 라이트 산란(DLS)28,29,또는 둘 다의 조합에 기초하여 크기에 민감한 광 산란 검출기와 같은 다중 검출기와 다운스트림을 결합하여 추가 형상 정보를 얻을 수있다 30,31. 그러나, FFF 채널내 시료의 보존 거동은 일반적으로 잘 정의된 물리적 힘에 의해 제어되기 때문에, 간단한 농도 검출기(예를 들어, UV-vis 검출기)가 용출시32,33의존재를 나타내기에 충분한 수학적 접근법(FFF 이론)을 사용하여 크기를 계산할 수 있다.
세 번째 옵션으로, 우리는 UV-vis검출과결합된 AF4를 사용하여 서스펜션에서 알 수 없는 금 나노입자 샘플의 크기 조정을 위해 20-100 nm의 크기 범위에서 잘 정의된 AuNP 표준을 사용하여 외부 크기 보정34,35의 적용을 보고합니다. 이 간단한 실험 설정은 가능한 한 많은 실험실이 국제 실험실 간 비교 (ILC)에 가입 할 수 있도록 의도적으로 선택되었으며, 나중에 여기에 제시 된 프로토콜에 따라 유럽 연합 호라이즌 2020 프로젝트 ACEnano의 프레임에서 수행되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-FIL-TEF-002</td>
			<td>Used for filtration of aqueous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Durapore Millex</td>
			<td>Used for filtration of NovaChem100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Research Plus</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 cartridge</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ENTRIS124I-1S</td>
			<td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN5300</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel Oven</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN4020</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossflow Module</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF Control Module</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>ep T.I.P.S</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>1-0199</td>
			<td>Used for eluent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1131</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>VIA-002</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaCal Gold</td>
			<td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VIBRAX-VXR</td>
			<td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer (PC)</td>
			<td>Dell Technologies</td>
			<td>/</td>
			<td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>In accordance with respective laboratory&#8217;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-VIA-09150868</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &#8805;99 %, Blotting Grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>2326.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &#8805;98 %, p.a</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Control and Data Acquisition</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaFFF AF2000 Software</td>
			<td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Data Evaluation</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaAnalysis Software</td>
			<td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for final Data Processing</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Origin 2019</td>
			<td>Used for final data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Degasser</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7520</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Selector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7310</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Organizer</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7140</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant Mixture</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaChem100</td>
			<td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1130</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unknown AuNP sample</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC60</td>
			<td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis Detector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN3211</td>
			<td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Eluent Filtration System</td>
			<td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Milli-Q Integral 5</td>
			<td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&#937;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

입자 크기는 틀림없이 나노 입자의 개념과 관련된 가장 중요한 물리 화학 파라미터입니다. 나노 입자의 크기와 크기 분포에 대한 정확한 지식은 다양한 응용 분야에서 가장 중요합니다. 크기 범위는 나노 입자 용량의 가장 "활성"구성 요소를 정의하기 때문에 중요합니다.
비대칭 유동 필드-흐름 분획(AF4)은 약 1-1000 nm의 크기 범위에서 현탁액의 입자 크기를 조정하는 강력한 기술입니다. AF4 실험에서 크기 정보를 파생하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 다각광 산란 또는 다이나믹 라이트 산란의 원리에 따라 크기에 민감한 검출기와 온라인으로 AF4를 결합하는 것 외에도, 잘 확립된 이론적 접근법(FFF 이론)을 사용하여 시료의 크기를 보존 시간과 상관연관하거나 잘 정의된 입자 크기 표준(외부 크기 교정)의 보존 시간과 비교할 가능성도 있다.
여기서는 20-100 nm 크기의 크기 범위에서 금 나노 입자 표준과 외부 크기 교정을 사용하여 UV-vis 검출과 결합된 AF4에 의한 알 수 없는 금 나노 입자 샘플의 크기 조정을 위한 표준 작동 절차(SOP)의 개발 및 사내 검증을 설명합니다. 이 절차는 샘플 준비, AF4 계측기 설정 및 검증, AF4 방법 개발 및 알 수없는 금 나노 입자 샘플의 분획을 포함한 개발 된 워크플로우에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 확립 된 외부 크기 교정과 얻은 결과의 상관 관계를 제공합니다. 여기서 설명된 SOP는 결국 서스펜션에서 나노 미립자 시료의 크기 조정을 위한 AF4의 우수한 견고성과 신뢰성을 강조하는 실험실 간 비교 연구의 프레임에서 성공적으로 검증되었습니다.

첫째, AuNP 크기 표준은 AF4에 의해 분획되고 532nm(AuNP의 표면 플라스몬 공명)에서 AuNP의 흡광도를 측정하는 UV-vis에 의해 검출되었다. 얻어진 프랙토그램의 오버레이는 도 1에제시된다. 삼중 측정에서 얻은 각 Uv-vis 피크 최대값에서 각 AuNP의 보존 시간은 표 5에나열됩니다. 모든 보존 시간의 상대적인 표준 편차는 크기가 증가함에 따라 측정 차이가 감소하면서 1.1% 미만이었습니다. 전반적으로, 우수한 반복성을 달성했다. 일정한 분리 력이 적용되어 용출 시간과 유체 역학 크기의 선형 관계가 발생했습니다. 외부 크기 보정 라인은 보이드 시간 보정 된 용출 시간 (순 보존 시간)에 대해 지정된 유체 역학 반경을 플로팅하여 설정되었습니다. 선형 회귀 분석 결과 인터셉트a =-3.373 nm ± 1.716 nm 및 슬로프 b = 1.209 nm∙min-1 ± 0.055 nm+min-1을가진 선형 교정 함수가 생성되었다. 용출의 선형 거동은 0.9958의 제곱 된 상관 계수 R2로 확인되었다. 각 교정 함수는 도 2에시각적으로 표시됩니다.
두 번째 부분은 알 수 없는 AuNP 샘플의 분석을 다루었습니다. 시료의 3개의 알리쿼트(aliquots)는 프로토콜섹션(섹션 4.2)에기재된 절차에 따라 제조되었다. 각각 3개의 알리쿼트들은 AuNP 크기 표준에도 적용된 동일한 AF4 분획 방법을 사용하여 삼중에서 조사되었다. 알 수 없는 AuNP 샘플에서 얻은 9개의 AF4-UV-vis fractograms는 모두 도 3에 제시되고 각각의 평가는 표 6에요약된다. 각 보존 시간의 상대적 표준 편차는 상당히 낮았으며 0.1 %에서 0.5 % 사이로 배열되었습니다. AuNP 크기 표준의 분획으로부터 얻은 입자 크기 보정 기능을 사용하여 UV-vis 피크 최대값에서 알 수 없는 AuNP 샘플의 획득된 보존 시간과 상관관계가 있으며, 전체 평균 유체 역학 반경 29.4nm ± 0.2nm를 계산할 수 있다. 더욱이, 83.1%의 합리적인 질량 회수는 1.2%± AuNP 시료의 유의한 응집 또는 용해 또는 막 표면에 입자의 상당한 흡착을 나타내지 않는 것을 나타낸다. 도 4는 적용된 AF4 방법의 우수한 견고성을 강조하여 평균 9개의 UV-vis 신호 추적을 통해 얻어진 입자 크기 분포를 표시합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> 그림 1: 정규화된 신호 강도로 4개의 개별 AuNP 크기 교정 표준의 삼중 분석에서 얻은 AF4-UV-vis fractograms및 지속적인 교차 유량(black line)을 적용하였다. 보이드 피크는 약 5.9분 에서 회색으로 강조 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">표시됩니다.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> 그림 2: 각 개별 AuNP 크기 교정 표준의 보존 시간에 대해 지정된 유체역학 반경을 플로팅한 후 각 DLS측정(표 4)과얻어진 AF4 보존 시간(표5)의각 표준 편차로부터 파생된 오차 바를 포함하는 외부 크기 교정 기능을 획득하였다. y =-3.373 nm ± 1.716 nm 및 b = 1.209 nm·민-1 ± 0.055 nm·min-1을 가진 y=a +bx 형태의 표준 오차가 있는 선형 교정 함수는 선형 회귀 분석에서 계산되었다. R2 = 0.9958과의 제곱 된 상관 관계 계수가 결정되어 선형 관계를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> 그림 3: AF4-UV-비스 프랙토그램의 삼중 측식 측정은 알 수 없는 AuNP를 표시하는 3개의 알리쿼트. 측정 시간 동안 적용된 상수 교차 유량은 검은색 선으로 도시된다. 약 5.9분의 보이드 피크가 회색으로 강조 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> 그림 4: 알 수 없는 AuNP 샘플및 적용된 선형 교정 함수(점선)의 얻어진 평균 입자 크기 분포(red)의 오버레이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">구성 요소</td>
			<td>CAS-아니오</td>
			<td>무게 (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">물</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-옥타데스노산 (Z)-, 2,2',2'-니트리로트리스[에탄올](1:1) 화합물</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">탄산나트륨</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">알코올, C12-14 보조, 에톡시</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">테트라나트륨 EDTA</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">폴리에틸렌 글리콜</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">올레아테 나트륨</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">중탄산나트륨</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 용액을 준비하는 데 사용되는 계면 활성제 혼합물의구성 요소 목록(재료 표 참조).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis 매개변수</td>
			<td>단위</td>
			<td>값</td>
		</tr>
<tr>
<td>스페이서 두께</td>
			<td>Μ m</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>검출기 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>교차 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>0(8분 동안 상수)</td>
		</tr>
<tr>
<td>초점 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>지연 시간/안정화 시간</td>
			<td>분</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>사출 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>전환 시간</td>
			<td>분</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>주입 시간</td>
			<td>분</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>용출 단계</td>
			<td>분</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>단계 헹기 시간</td>
			<td>분</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>헹기 단계 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>사출 볼륨</td>
			<td>μL</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>샘플 농도</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>멤브레인 타입</td>
			<td></td>
			<td>재생셀룰로오스</td>
		</tr>
<tr>
<td>멤브레인 분자량 차단</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>용인성</td>
			<td></td>
			<td>0.025% (v/v) 계면활성제 혼합물</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV 비스 파장</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis 감도</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 분리력의 적용 없이 직접 사출 실행을 수행하기 위한 AF4-UV-vis 분별 방법 파라미터의 요약.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis 매개변수</td>
			<td>단위</td>
			<td>값</td>
		</tr>
<tr>
<td>스페이서 두께</td>
			<td>Μ m</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>검출기 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>교차 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>1 (60분 상수, 10분 선형)</td>
		</tr>
<tr>
<td>초점 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>지연 시간/안정화 시간</td>
			<td>분</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>사출 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>전환 시간</td>
			<td>분</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>주입 시간</td>
			<td>분</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>용출 단계</td>
			<td>분</td>
			<td>70 (60분 상수, 10분 선형)</td>
		</tr>
<tr>
<td>헹기 단계</td>
			<td>분</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>헹기 단계 유량</td>
			<td>mL 분-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>사출 볼륨</td>
			<td>μL</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>샘플 농도</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>멤브레인 타입</td>
			<td></td>
			<td>재생셀룰로오스</td>
		</tr>
<tr>
<td>멤브레인 분자량 차단</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>용인성</td>
			<td></td>
			<td>0.025% (v/v) 계면활성제 혼합물</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV 비스 파장</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis 감도</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 분리력으로서 교차 흐름의 적용을 통해 분획 실행을 수행하기 위해 AF4-UV-vis 분별 법 매개변수의 요약.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>교정 표준</td>
			<td>캡핑 에이전트</td>
			<td>평균 크기(TEM) (nm)</td>
			<td>이력서(평균 크기 TEM) (%)</td>
			<td>제타 잠재력 (mV)</td>
			<td>SD(제타 잠재력) (mV)</td>
			<td>유체 역학 반경(DLS) (nm)</td>
			<td>SD(유체역학 적 반경) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>시트르산</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>시트르산</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>시트르산</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>시트르산</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: 적용된 AuNP 교정 표준의 물리화학 파라미터의 요약은, 상주 현탁액에서 결정된 제타 전위뿐만 아니라 DLS 유체역학 반경, 및 다분산지수(PDI)에서 결정된다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>교정 표준</td>
			<td>실행</td>
			<td>최대 최대(최소)의 보존 시간</td>
			<td>최대 최대(최소)의 순 보존 시간(최소)</td>
			<td>평균 순 보유 시간(최소)</td>
			<td>SD (%) (순보유시간)</td>
			<td>SD(최소) (순 보유 시간)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>표 5: 표 3에기재된 방법을 이용하여 각각의 AF4-UV-vis fractograms로부터 유래된 각각의 UV-Vis 피크 최대값에서 AuNP 교정 표준의 보존 시간.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>알리따옴표트</td>
			<td>실행</td>
			<td>보존 시간 최대(최소)</td>
			<td>최대 최대(최소)의 평균 보존 시간(최소)</td>
			<td>최대 최대(최소)의 순 보존 시간(최소)</td>
			<td>SD (%) 보존 시간</td>
			<td>유체 역학 반경(nm)</td>
			<td>복구(%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>표 6: 각 UV-Vis 피크 최대값에서 의 보존 시간을 요약하여, 외부 크기교정(도 2)으로부터계산된 유체역학 반경 및 AF4-UV-vis 분석에서 얻은 알 수 없는 AuNP 샘플의 회수율.

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Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

이 프로토콜은 알 수 없는 금 나노입자 샘플의 크기를 측정하기 위한 UV-vis 검출과 결합된 비대칭 유동 필드-흐름 분획의 사용을 설명합니다.

현탁액에서 금 나노 입자의 크기 조정을위한 비대칭 유동 필드 흐름 분획

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.0K 조회수.  Postnova Analytics GmbH. 이 프로토콜은 알 수 없는 금 나노입자 샘플의 크기를 측정하기 위한 UV-vis 검출과 결합된 비대칭 유동 필드-흐름 분획의 사용을 설명합니다.

비디오: Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

생물 학적 시스템에서 이온 농도의 측정을위한 형광 Nanoparticles

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

연구

생체공학

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

재생 연구를위한 고조파 나노 입자

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

액체에서의 펄스 레이저 어블 레이션에 의한 금속 나노 입자의 제조 : 나노 입자의 항균성 연구를위한 도구

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

단백질 키 니 아 제 C 델타 억제제 펩 티 드 배합 금 나노 입자를 사용 하 여

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

고분자 나노 입자에 소수 성 및 친수성 화합물의 캡슐화에 대 한 NanoPrecipitation 플래시

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...