체외 또는 생성된 인간 표피 모델은 동물 실험에 대한 대체 테스트 방법을 개발하는 주요 목표로 90년대에 처음 개발되었습니다. 이러한 3D 표피 모델은 이제 일반적으로 화장품 성분의 안전성과 효능을 테스트하는 데 사용됩니다. 여러 조직 공급 업체에서 구입할 수 있지만 실험실에서 3D 모델을 재구성 할 수 있다는 것은 관심의 끝점에 더 많은 유연성을 제공합니다.
3D 표피 모델의 재구성 프로토콜을 간략하게 설명하는 여러 연구 논문이 있지만 현재까지 는 재구성 프로세스의 중요한 단계를 보여주는 비디오가 없었습니다. 이것이 이 비디오 용지를 출판한 이유입니다. 사내 재건된 인간 표피의 제조는 배양 배지 조성의 변화, 프로 염증 또는 산화 스트레스 트리거, 관심 유전자의 침묵, 특정 생물학적 과정의 억제 또는 자극과 같은 배양 과정에서 많은 자유를 허용합니다.
우선, 유리병을 물에 잠급하여 섭씨 37도의 수조에서 100만 개의 극저온 보존 된 정상적인 인간 표피 각질 각질 세포 또는 NHEKs로 병병을 해동하십시오. 작은 얼음 조각만 보일 때까지 수조에서 1~2분 동안 바이알을 배양합니다. 2~3회 위아래로 파이프를 사용하여 셀을 매우 신중하게 재차 중단합니다.
셀 서스펜션을 사전 경고된 해동 배지의 총 15밀리리터를 포함하는 2개의 T75 플라스크로 전송하여, 제4 세포에 6.7배 10의 파종 밀도를 생성한다. 디스펜서 파이펫을 사용하여 침수 된 매체의 1.5 밀리리터로 24 개의 웰 플레이트를 미리 채웁니다. 세포를 80%의 수렴성으로 배양한 후, 재구성된 인간 표피 또는 RHE의 재배를 위해 인서트에 파종할 준비가 되어 있습니다.
NHEKs로 T75 플라스크에서 기저 매질을 제거합니다. 각 T75 플라스크에 미리 따뜻워진 PBS의 5밀리리터를 추가하여 세포를 헹구고 플라스크에서 PBS를 제거합니다. 각 플라스크에 사전 따뜻하게 된 0.05 %의 트립신-EDTA의 2 ~ 3 밀리리터를 추가하여 트립신 용액이 플라스크의 세포 배양 영역에 동등하게 분포되어 있는지 확인합니다.
세포 배양 인큐베이터에 플라스크를 4분 동안 놓고, 세포가 현미경을 사용하여 10 X 배율로 분리되는지 확인합니다. 플라스크표면에서 세포가 방출되는 것을 돕기 위해 플라스크를 랩합니다. 모든 세포가 분리되면 각 T75 플라스크에 미리 따뜻해지는 트립신 억제제의 동일한 볼륨을 추가하고 플라스크에서 원심분리기 튜브로 세포 현탁액을 전달합니다.
미리 따뜻워진 PBS의 5밀리리터로 플라스크를 헹구고 세포 현탁액을 포함하는 원심분리기 튜브로 옮김합니다. 수확된 세포를 5분 동안 400배 G로 원심분리합니다. 조심스럽게 튜브에 약 100 ~ 200 마이크로 리터를 떠나 상체의 대부분을 폐기.
조심스럽게 펠릿을 느슨하게 손가락으로 튜브를 가볍게 쓸어. 침수 된 매체의 낮은 부피로 세포의 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 균일 한 셀 서스펜션을 보장하기 위해 5 ~ 10 번 위아래로 피펫을 합니다. 셀 응집체의 형성을 피하기 위해 낮은 부피로 시작하고 초기 T75 플라스크당 최대 1밀리리터의 침수 된 배지를 추가하십시오.
트라이판 블루 제외 방법을 사용하여 서스펜션의 셀을 계산합니다. 텍스트 원고에 제공된 첫 번째 방정식을 사용하여 밀리리터당 5번째 세포에 3.525배의 농도에 도달하기 위해 추가 침수 배지로 세포 현탁액을 희석한다. 희석된 용액의 제2 셀 카운트를 수행하고 텍스트 원고의 두 번째 방정식을 사용하여 배양 삽입체로 시드되는 셀 서스펜션 볼륨을 계산합니다.
24개의 웰 배양인기를 캐리어 플레이트의 가장 높은 위치에 걸고, 담수매로 미리 채워진 24개의 웰 플레이트로 캐리어 플레이트를 옮기한다. 각 삽입에 셀 서스펜션의 결정된 볼륨을 추가하여 삽입을 만지지 않도록 주의하십시오. 시드 후, 에지 효과를 극복하기 위해 실온에서 10~ 15분 동안 24개의 웰 플레이트를 배양합니다.
이 시간 동안 플레이트를 이동하지 마십시오. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮기고 3일 동안 침수된 상태로 둡니다. 세포 배양 인큐베이터에서 3일간의 인큐베이션 후, 흡인계또는 ALI에 멤브레인 표면에 부착된 세포를 흡혈구로부터 포부 시스템과 유리 파스퇴르 파이펫으로 제거하여 노출한다.
새로운 24개의 웰 플레이트를 1.5밀리리터의 신선한 미리 데운 ALI 배지로 채우고, 배양 물자를 새로운 멀티웰 플레이트로 옮길 수 있습니다. 다중 웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 다시 이송합니다. ALI 배지를 2~3일마다 14일 동안 새로 고칩니다.
2D 배양식각막세포는 일관된 다각형 모양을 가진 전통적인 형태를 표시합니다. ALI에서 15 일 후, 재건 된 인간 표피는 완전히 계층화 된 조직을 형성하며, 이는 네 가지 주요 표피 층으로 표시됩니다. 재구성 프로토콜의 다른 시점에서 재구성된 인간 표피의 초구조적 분석은 시간이 지남에 따라 각막 부위 층의 수가 증가함에 따라 옥수수 화 과정을 나타낸다.
표피의 각질 세포는 그들의 분화 단계에 따라 다른 단백질 발현 프로파일을 보여줍니다. Involucrin 발현은 SG 계층에서 더 주로 나타나는 반면 필라그린과 로리크린의 발현은 상층층에 있습니다. 케라틴-10 식은 SB 층을 제외한 모든 실행 가능한 계층에서 발견되었다.
재구성된 인간 표피는 실행 가능한 표피 층의 세포간 공간에서 Desmoglein-1의 발현에 의해 표시된 기능성 탈모소말 접합을 표시합니다. 재건된 표피 모델의 장벽 특성은 알려진 장벽 파괴자와 국소 치료에 대한 조직 생존가능성을 평가하고 조직 무결성을 평가하여 조사되었습니다. 조직 무결성은 15일 후에 볼트계로 TEER을 측정하여 결정하였다.
리포폴리사카라이드 및 종양 괴사 인자 알파에 대한 표피의 반응성을 조사되었다. LPS와 TNF 알파 치료 모두 무독성이었다. 트리톤 X-100 컨트롤에 상대적입니다.
RHE 배지에서 인터류킨-1 알파 및 인터류킨-8의 방출은 IL 용액을 사용하여 정량화되었다. LPS 치료는 인터류빈-1 알파 및 인터류빈-8의 방출에서 통계적으로 유의한 업-레페터의 결과를 낳았다. TNF 알파 치료는 인터류신-1 알파의 방출에서통계적으로 유의한 업-레퍼티레이션을 초래했다.
그러나, 인터류빈-8 레벨증가의 명확한 경향은 또한 TNF 알파를 가진 자극시 관찰되었다. 이 프로토콜에 따라 TEER는 장벽 무결성을 위한 값으로 측정할 수 있습니다. 생존성 또는 세포 독성은 예를 들어 MTT 또는 LDH 분석에 의해 측정될 수 있다.
상체는 사이토카인 또는 다른 단백질의 분비를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 조직은 단백질 또는 관심있는 유전자의 발현을 연구하기 위하여 이용될 수 있다.
