이 프로토콜은 일차 마우스 간세포에서 총 미토콘드리아 및 퍼옥시솜 지방산 베타 산화의 측정을 위한 강력한 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 무손상 세포의 사용은 소기관 완전성과 조절 메커니즘을 유지합니다. 추가적으로, 갓 분리된 간세포를 분석하면 기원의 간에서 유전자 발현의 변화를 최소화할 수 있다.
수술은 어려울 수 있습니다. 자신감 있고 부지런하며 집중해야합니다. 통조림이 성공하면 시도하고 긴장을 풀지 만주의를 기울이고 관류의 품질을 모니터링하십시오.
절차를 시작하려면 마취 된 마우스의 복부와 가슴에 70 % 에탄올을 자유롭게 뿌리십시오. 그런 다음 포셉을 사용하여 복부 바닥 근처의 피부와 복벽을 당기고 중간 선의 양쪽과 횡격막까지 옆으로 잘라 장기를 노출시킵니다. 창자를 오른쪽으로 움직이고 간장의 엽을 부드럽게 뒤집어 열등한 정맥 카바 (IVC)를 노출시킵니다.
바늘 뚜껑과 같은 작은 원통형 물체를 마우스 뒤쪽 아래에 삽입하여 IVC를 약간 기울이고 통조림을 용이하게하십시오. 가장 낮은 속도로 버퍼 하나로 펌프를 시작한 후 바늘을 IVC에 삽입하십시오. 그런 다음 포털 정맥을 잘라 압력을 완화하고 혈액 및 관류 버퍼의 배수를 허용하십시오.
유속을 분당 일곱 mL로 증가시키기 전에. 따뜻한 버퍼 하나로 간을 관류시키고 버퍼 하나가 들어있는 튜브에 삽입 된 라인이 기포가 유입되지 않도록 지속적으로 잠겨 있는지 확인하십시오. 관류가 발생하는 동안 130 마이크로 리터의 콜라게나제 용액을 첨가하여 두 개의 완충액을 넣고 혈청 학적 피펫으로 피펫팅하여 혼합하십시오.
버퍼 하나를 포함하는 튜브 내의 부피가 약 다섯 mL로 감소함에 따라, 튜브의 측면에 피펫팅하여 버퍼 하나를 버퍼링하기 위해 버퍼 두 mL의 다섯 mL를 천천히 첨가한다. 튜브에 나머지 버퍼 두 개를 추가하기 전에 추가를 두 번 반복하십시오. 약 5 내지 10 mL의 완충액 두 개가 튜브에 남아있을 때 관류를 중단한다.
그런 다음 간을 절제하고 얼음처럼 차가운 완충액 20mL를 함유하는 100-mL 배양 접시로 옮깁니다. 층류 후드 아래에서 외과 용 가위와 핀셋을 사용하여 간 조직을 부드럽게 분리하십시오. 다음으로 간세포 현탁액에 약 20mL의 얼음처럼 차가운 M199 완충액을 첨가하고 주사기의 플런저를 사용하여 100미크론 세포 스트레이너를 통해 여과하여 더 큰 간 조각으로부터 추가적인 간세포의 방출을 부드럽게 촉진한다.
100-mL 배양 접시 및 세포 스트레이너를 M199 완충액으로 세척하여 수집 튜브가 가득 찰 때까지 세포 현탁액을 수집한다. 이어서, 현탁액을 섭씨 네 도에서 두 분 동안 50 x g에서 원심분리한다. 소용돌이에 의해 차가운 M199의 30 mL에 간세포 펠릿을 재현탁시키기 전에 상청액을 흡인시킨다.
세탁을 한 번 반복하십시오. 다중 반응을 위한 기질 혼합물을 제조하기 전에 팔미트산 및 소 혈청 알부민, 또는 BSA, 용액을 해동시킨다. 분취량 13.5 마이크로리터의 BSA 용액을 마이크로원심분리 튜브에서 반응시켰다.
튜브를 섭씨 41도까지 따뜻하게 한 후, 반응 당 200 mM 팔미트산 용액 1 마이크로리터를 첨가한다. 가용성 팔미트산-BSA 복합체의 형성을 촉진하기 위해 섭씨 41도에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션 전과 도중에 튜브를 격렬하게 소용돌이친다. 이 시간 동안, 1 M의 과염소산의 분취량 133 마이크로리터는 분리된 1.5-mL 마이크로원심분리 튜브에서 반응을 중지시키는데 사용될 것이다.
반응을 시작하기 전에, 분취량 및 반응당 485.5 마이크로리터의 M199 완충액을 섭씨 37도의 튜브에 인큐베이션하여 제조된 방사성 BSA-팔미트산 복합체를 희석시킨다. 다음으로 억제제가 있든 없든 750 마이크로리터의 M199를 샘플로서 분리된 14-mL 둥근 바닥 튜브에 분배한다. 간세포 세척 단계 동안, 반응을 시작하기 10 내지 15분 전에, 튜브를 분당 180 내지 200회 회전으로 섭씨 37도로 설정된 진탕 수조로 옮긴다.
간세포의 생존율이 75% 이상인 경우 반응 당 0.8 마이크로리터의 탄소-14 팔미트산을 정화된 BSA-팔미트산 용액을 함유하는 미세원심분리 튜브로 옮겨 기질 믹스의 제조를 완료한다. 섭씨 41도에서 수조로 튜브를 반환하기 전에 소용돌이. 최종 간세포 재현탁 직후, 750 마이크로리터의 간세포 현탁액을 하나의 mL 피펫을 사용하여 진탕 수조의 각 14-mL 둥근 바닥 튜브로 옮기고 튜브를 저속으로 잠깐 와류시킨 후 인큐베이터로 옮기기 전에 30초 동안 각 첨가를 비틀었다.
간세포의 분리된 분취량을 1.5-mL 마이크로원심분리 튜브에 옮겨 5분 동안 3000 x g에서 회전시킨다. 펠렛을 영하 80도에서 보관하기 전에 상층액을 제거하여 시료 중의 단백질 총량을 측정하여 결과를 정상화한다. 간세포가 섭씨 37도에서 예비 배양되는 동안, 방사성 BSA-팔미트산 복합체를 따뜻한 배지에 첨가하여 반응을 시작할 준비가 될 때까지 섭씨 37도에서 유지하십시오.
반응을 시작하려면 수조에서 간세포를 제거하고 500 마이크로 리터의 기질 믹스를 간세포에 첨가하십시오. 세포를 5초 동안 저속으로 소용돌이 치고, 수조로 복귀하기 전에 15분 동안 인큐베이션한다. 일련의 반응을 시작하고 즉시 멈추고 배경 방사능을 결정하십시오.
200 내지 250 마이크로리터의 남은 기질 믹스의 중복 분취량을 6-mL 섬광 바이알에 옮기고 따로 놓아 계수를 수행한다. 반응을 중지하려면 수조에서 간세포를 제거하고 적당한 속도로 볼텍싱하여 재현탁 한 다음 400 마이크로 리터의 간세포 현탁액을 과염소산이 함유 된 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 모든 샘플에 대한 서열을 반복하기 전에 튜브를 즉시 캡하고 와류하여 30 초까지 비틀 거립니다.
1.5-mL 마이크로원심분리 튜브를 13, 000 x g에서 10분 동안 방사한 후, 상층액 300 마이크로리터를 6-mL 섬광 바이알로 옮기고 섬광 유체 4 mL를 첨가하여 섬광 계수기에서 샘플과 기질 혼합 분취액의 방사능을 계수한다. 이 연구에서 간 관류는 간 당 30 ~ 40 백만 개의 세포를 산출했으며 평균 생존력은 80 %였으며 공복 그룹의 포도당 농도를 낮추면 간세포의 수율이나 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것도 관찰되었습니다. 먹이를 먹고 금식한 수컷 마우스로부터 분리된 간세포 현탁액을, CPT1 및 미토콘드리아 지방산 산화의 강력한 억제제인 에토목시르의 존재 및 부재 하에서의 지방산 베타 산화 능력에 대해 검정하였다.
배경 방사능과 관련된 분당 카운트 또는 CPM은 팔미트산의 배치에 따라 다릅니다. 그러나, CPM은 여전히 기질 믹스와 함께 인큐베이션된 샘플보다 상당히 낮았다. 금식 마우스로부터 분리된 간세포는 미토콘드리아 및 퍼옥시솜 지방산 베타 산화 속도의 강력한 증가를 보여준다.
데이터는 먹이를 먹고 금식한 마우스로부터 분리된 간세포에서 팔미트산이 산화되는 속도를 결정하기 위해 추가로 연구되었다. 거품이 선으로 들어가지 않도록 합니다. 관류 중에 바늘을 일정하게 유지하십시오.
간세포를 다룰 때 부드럽게하십시오. 분배 할 때 서스펜션에 보관하십시오. 이 절차로부터 분리된 간세포는 지방산 합성과 같은 다른 대사 경로를 분석하기 위한 현탁액으로서 사용될 수 있거나, 또는 이들은 세포 배양 실험을 위해 플레이팅될 수 있다.
