이 프로토콜은 동물 모델없이 병리 생리학을 조사하기 위해 추간판 변성의 생체 내 상태를 시뮬레이션하는 것을 목표로합니다. 체외 세포 배양과 비교하여, 생물 반응기 장기 배양 기술은 제어 가능하고 재현 가능한 배양 조건의 공급 이외에 그들의 토착 생물학 및 생물 기계적 미세 환경에서 세포를 유지합니다. 표면에 먼지와 머리카락을 제거하기 위해 수돗물로 전체 소 꼬리를 완전히 헹구는 것으로 시작한 다음 1 % 베타 딘 용액으로 꼬리를 10 분 동안 담그면 표면을 소독하십시오.
두근 두근 번호(20)를 사용하여 코달 척추에서 연조직을 제거하여 추간판 또는 IVD의 식별을 용이하게 한다. 뼈 제거 펜치로 척추의 가시 및 횡방향 공정을 제거합니다. 각 척추 몸의 중간을 통해 뼈 펜치와 반대로 잘라 개별 모션 세그먼트를 얻은 다음 링거의 용액에 젖은 거즈와 페트리 접시에 수집 된 모션 세그먼트를 넣습니다.
운동 세그먼트를 부드럽게 이동하여 척추에 IVD를 찾은 다음 뼈 끝 판의 볼록한 면을 만지고 찾아서 성장 판의 위치를 식별합니다. 링거의 용액으로 밴드톱의 블레이드를 식히고 IVDs의 성장 판에 두 개의 병렬 컷을 만드는 데 사용합니다. 링거의 용액에 젖은 깨끗한 거즈와 깨끗한 페트리 접시에 IVDs를 전송합니다.
메스 블레이드를 사용하여 척추 몸체와 성장 판을 긁어 최종 플레이트를 그대로 둡니다. 두 표면을 평평하게 배치하고 로딩 절차를 위해 긁힌 IVD를 링거의 용액에 젖은 거즈가 있는 신선한 페트리 접시에 옮습니다. 캘리퍼로 디스크 높이와 직경을 측정한 다음 제트 라베이지 시스템을 사용하여 링거의 용액으로 척추 뼈의 혈전을 청소합니다.
PBS에서 IVDs를 소독하고 15 분 동안 흔들어 10 % 페니실린 연쇄 절제술. PBS와 1%페니실린 연쇄 절제술로 고농도 항생제를 헹구는 다. IVD 배양 배지 의 5 밀리리터를 포함하는 IVD 챔버로 디스크를 전송하고 85 %의 습도와 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 인큐베이터를 가진 생물 반응기 시스템에 배치합니다.
실험군에 따라 상이한 하중 조건을 유지하여 생물반응기 시스템 내에서 4일 동안 디스크를 배양한다. 생리대조군에서는, 0.02~0.2메가파스칼및 0.2 헤르츠의 로딩 프로토콜을 이용하여 고혈당 배지를 가진 IVD를 하루 2시간 동안 배양한다. 병리학 적 그룹에서, 배양 IVDs 낮은 포도당 배지의 로딩 프로토콜을 사용하여 0.32 받는 르 0.5 메가 파스칼 및 5 헤르츠 하루 2 시간 동안.
로딩 절차 사이에 IVD를 6웰 플레이트에 7밀리리터의 IVD 배양 배지를 놓아 무료 부종 회복을 합니다. 무료 붓기 후 및 실험 기간 동안 동적 로딩 후 캘리퍼로 매일 디스크 높이를 측정합니다. 첫날 첫 번째 동적 로딩 주기 후, 직접 수직 위치에 페트리 접시에 IVDs를 배치하고 트위저로 안정화.
병리학 적 그룹의 IVD에 분당 약 70 마이크로 리터의 속도로 천천히 30 게이지 인슐린 바늘로 재조합 TNF-알파를 주입하십시오. 주입 후 주사기를 반쯤 뒤로 당기고 플런저를 당겨 주입된 용액이 누출되는 것을 방지하는 진공을 만든 다음 IVD에서 주사기를 완전히 제거합니다. 퇴행성 로딩은 제한된 영양 공급과 TNF-알파 주입과 결합하여 4일간의 배양 후 NP 조직에서 프로 염증 성 마커 인터류키 6 및 인터류키8의 유전자 발현이 현저한 증가를 일으켰습니다.
인터류킨 8단백질 방출은 조건부 배지로 2일째와 4일째에 병리학군의 현저한 증가를 보였다. 적재 후 디스크 높이 감소는 생리군에 비해 병리학군에서 더 높았으며, 1일 대비 2일과 3일 후에 차이가 더 뚜렷하게 나타났다. 표준화된 해부 기술은 재현 가능한 IVD 전신 장기 배양 모델에 중요합니다.
생체 반응기는 다양한 생체 내 생체 역학 조건을 시뮬레이션하기 위해 IVD에 생리적 및 퇴행성 적재를 적용해야 합니다. 이 기술은 높은 임상 관련성의 인간 IVD 이식에 적용될 수 있습니다. 초기 단계 디스크 변성에서 효과적인 치료법을 개발하기 위한 새로운 전임상 모델입니다.
