이 프로토콜은 망막 뉴런의 미세한 형태학의 조사를 허용하고 질병 상태에서 발생하는 세포 및 세포 체형 변화에 대한 통찰력을 줄 수 있습니다. 이 방법은 망막의 광학 적 투명성을 크게 향상시키고 호르몬 망막 준비에서 망막 뉴런의 고해상도, 3 차원 이미징, 회로 배선 및 미세 하위 세포 구조를 허용합니다. 마우스 눈을 구부러진 집게로 이결시키고 0.1 M PBS가 있는 작은 페트리 접시로 옮킨다.
실부 현미경의 밑에 바늘과 각막 clera 접합을 따라 작은 구멍을 찌른 다음 1 시간 동안 4%의 힘 포름알데히드로 눈을 전송합니다. 눈을 PBS로 접시에 다시 옮기. 해부 현미경에서 해부 가위를 사용하여 코로클레럴 접합부 주변을 잘라냅니다.
각막과 렌즈를 제거합니다. 그런 다음 시신경의 기지에서 잘라 조심스럽게 망막을 분리하는 집게로 clera를 벗겨. 망막 주위에 네 개의 작은 컷을 고르게 만들고 PBS에 담근 미세 한 팁 브러시를 사용하여 니트로 셀룰로오스 필터 용지에서 작은 사각형 컷에 클로버 모양으로 평평한 GCL 면을 놓습니다.
니트로셀룰로오스 종이의 모서리를 집게로 집어 들고 48개의 웰 플레이트에 4%의 포름알데히드가 1시간 동안 넣고, 필터 용지와 망막을 PBS로 잘 옮기고 각각 5분간 3회 세척합니다. 얼음에 A4P0 솔루션을 해동. 그런 다음 망막을 A4P0 솔루션으로 옮기고 완만한 동요로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
식물성 기름을 우물에 추가하여 A4P0 용액을 완전히 덮습니다. 흔들림 없이 3시간 동안 섭씨 40도에서 수조에 배양하십시오. 그런 다음 PBS에서 세 번 씻고 세척당 5 분간 씻습니다.
망막을 섭씨 40도에서 2일 동안 섭씨 40도에서 배양한 다음 필터 용지와 망막을 Triton X-100으로 PBS로 옮기고 세척당 90분 동안 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 0.01%의 아지드 나트륨으로 PBS-T의 섭씨 4도에 망막을 보관하거나 면역 염색으로 직접 이동합니다. PBS-T의 미세 한 팁 브러시로 부드럽게 벗겨서 필터 용지에서 망막을 제거하십시오.
1 차적인 항체에서 배양된 것은 부드러운 흔들림으로 섭씨 40도에서 2일 동안 차단용액에 희석됩니다. 인큐베이션 후 PBS-T에서 90분 동안 5회 세척합니다. 완두르기와 함께 섭씨 40도에서 2일 동안 차단용액에 희석된 적절한 이차 항체로 망막을 배양한다.
절차의 나머지 부분에서 빛으로부터 샘플을 보호합니다. 망막을 0.02 M 인산염 버퍼로 90분 동안 5회 세척합니다. 마지막으로 부드러운 흔들림으로 밤새 섭씨 40도에서 소르비톨 기반 굴절 지수 매칭 솔루션의 망막을 배양합니다.
유리 현미경 슬라이드 뒷면에 사각형 경계를 표시하는 미세 팁 영구 마커와 유리 커버 슬립을 윤곽. 슬라이드를 뒤집어 주사기를 사용하여 슬라이드 전면에 얇은 실리콘 그리스 라인으로 경계를 추적합니다. 여분의 장착 솔루션이 탈출할 수 있도록 한 구석에 작은 간격을 둡니다.
망막을 경계 영역의 중앙으로 옮기고 미세 한 팁 브러시로 배치하여 유리 슬라이드에 대한 광수용체 측면과 평평하게 놓습니다. 파이펫 약 60 마이크로리터의 sRIMS를 통해 평평한 망막을 덮고 인클로저의 한 구석으로 확장됩니다. 망막이 평평하고 제자리에 유지되도록 하십시오.
커버 슬립을 바르고, 스림으로 모퉁이에서 시작하여 모든 면의 그리스에 닿을 때까지 천천히 낮춥힙. 장착된 망막의 양쪽에 세 개의 커버 슬립을 스페이서로 놓습니다. 다른 슬라이드의 긴 가장자리를 사용하여 마운트가 평평하고 균일하도록 커버 슬립을 누릅니다.
슬라이드를 이미징할 때까지 섭씨 4도에 저장합니다. 현미경 단계에 슬라이드를 배치하고 샘플을 찾는 것으로 시작합니다. 샘플의 Z 누적 된 이미지를 얻으려면 먼저 각 채널의 신호에 개별적으로 초점을 맞추고 형광 또는 공초점 현미경에 대한 노출 시간 또는 스캔 속도를 각각 설정합니다.
원하는 범위의 위쪽과 하단에 초점 평면을 수동으로 설정하거나 중간점을 설정한 다음 중간점 주변의 범위를 지정하여 Z 스택의 범위를 설정합니다. 원하는 대로 단계 크기 또는 슬라이스 수를 조정합니다. 이미지를 캡처하고 원본 파일을 저장합니다.
그런 다음 TIF 파일 또는 다른 원하는 형식으로 내보내. 이미지 분석, 선택한 소프트웨어를 사용하여 단일 이미지와 Z 스택의 3차원 렌더링 모두에서 최적의 선명도가 달성될 때까지 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다. 수정된 CLARITY 프로토콜로 처리될 때 망막의 두께 전반에 걸쳐 광학 투명성을 완료하여 비처리 된 제어 망막에 비해 관찰하였다.
ONL의 Arrestin 표지 콘에 대한 Z 누적 이미지, INL에서 DAC로 레이블이 지정된 TH, GCL에서 RG로 표시된 RBPMS가 여기에 표시됩니다. 망막의 전체 두께를 통해 뉴런의 상대적 위치는 오버레이 이미지에서 관찰되었다. TH 염색 및 CLARITY 처리 전체 산 망막 표준 준비에서 얻은 이미지와 비교되었다.
DAC의 Dendrites 및 축삭 과 같은 프로세스는 표준 망막에서 보다는 명확하게 가공된 망막에서 더 명확하게 드러났습니다. DACs의 축삭 과 같은 프로세스는 표준 망막에 비해 선명한 망막에 완전한 고리 와 같은 구조를 전시했습니다. 형광 현미경 검사를 사용하여 취한 CLARITY 망막의 고리 같은 구조는 공초점 현미경 검사를 사용하여 관찰된 것과 거의 동일했습니다.
축사와 같은 과정은 또한 외부 망막을 향해 달렸다. GluA2 및 PSD-95에 대한 면역 염색은 AMPA 수용체와 퍼티션 포스트 시냅스 부위를 각각 포함하는 개별 GluA2를 드러내는 뚜렷한 말장난을 보였다. 오버레이 이미지는 DAC 프로세스에 대한 몇 가지 말장난을 보여 주었다.
공동 지역화의 포인트는 XZ, YZ 및 XY 평면및 TH가 GluA2 및 PSD-95와 함께 명확하게 공동 지역화되었습니다. 지워진 망막이 장착 및 이미징 공정을 위해 평평하게 배치될 수 있도록 하이드로겔 중합 공정 중에 망막이 평평하게 유지하는 것이 중요합니다.
