우리 감사 합니다 IGBMC 높은 처리량 시퀀싱 시설, "프랑스 Génomique" 컨소시엄 (ANR10-INBS-09-08)의 회원 및 모든 IGBMC 일반 서비스의 모든 직원 들은 특히 IGBMC 동물 시설 직원을. 이 작품은 CNRS는 INSERM, AFM, 국가 리그 죄수 르 암에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 프랑스 프로그램 ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 표시 하는 Investissements d'Avenir에서 ANR 통해 펀드와 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. S.J 지원 했다 국가 리그 죄수 르 암과 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, V.U Ministère de l'Enseignement에 의해 동부 표준시 드 라 Recherche. ID는 'équipe labellisée' 국가 리그 죄수 르 암입니다.

관리 및 실험 동물의 사용에 관한 기관 지침에 따라 그리고 국가 동물 관리 지침 (유럽 위원회 지시 86/609/CEE;에 따라 마우스 유지 했다 프랑스어 법령 no.87-848). 모든 절차는 프랑스 국가 윤리 위원회에 의해 승인 했다.
 1. 절연의 근육 조직 경부 전위에 의해 <ol><li>희생 한 성인 6 8 주 오래 된 마우스. Sterlise 70% 에탄올과 그것을 rinsing 하 여 사지 및 좋은 포인트가 위와 집게를 사용 하 여 뒷 다리 근육 (Gastrocnemius, Tibialis 앞쪽 허벅지 근육)를 해 부. 
	참고: 하나의 마우스 조직의 약 500 밀리 그램을 산출 해야 한다.</li>
	<li>소규모의 동질적인 준비 얼음 소형 버퍼의 1 mL를 포함 하는 2 mL 테스트 튜브에 있는 근육을 말하다 (&#60; 2-3 m m 3) 조각을 사용 하 여가 위를 잘 하 고 5-10 분 4 ° C에서 벤치 가기 교 반기에 떨고 관 두고</li>
</ol> 2. 조직 세포 참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>14 mL 라운드-하단 튜브는 homogenate 전송 및 5 mL 차가운 소형 버퍼 (EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 PMSF)에서 resuspend.
	<li>Homogenise 15-30의 라운드-하단 14 mL 튜브에 대 한 느슨한 dounce (20-30 선 3 분 이내) 또는 기계적 조직 균질 화기를 사용 하 여 다진된 근육 조직 <ol>. 
		참고: 세포의 효율성, 가벼운 현미경에 의해이 단계에서 평가 될 수 있다 하 고, 필요한 경우 추가 중단을 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>15 mL 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 10 ml 차가운 소형 버퍼를 사용 하 여 볼륨을 채우기. homogenate 다음 마우스와 함께 진행 하기 전에 아래와 같이 수정.</li>
</ol> 3. 고정 <ol><li>1% 최종 농도에 포름알데히드를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 흔들어.</li>
	<li>고정 및 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 동요를 막으려고 각 관에서 0.125 M의 최종 농도에 글리신을 추가.</li>
</ol> 4. 핵 준비 참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>고정 lysate 사용 (5-10 스트로크) 느슨한 dounce Homogenise.
	<ol><li>전송 15 mL 튜브와 4 ° C에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기를 핵 및 세포질 파편.</li>
	</ol></li> <li>는 상쾌한을 제거 하 고 신선한 5 mL 소형 버퍼에 펠 릿을 resuspend. 필터링은 lysate 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 튜브에. 다시는 filtrate 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링.</li>
	<li>핵 펠 렛을 얻기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 15 mL 튜브와 1000 x g에서 원심 분리기에는 filtrate 전송. 
	참고:이 단계에서 핵 수 있습니다 sonicated 즉시 수, 또는 건조 한 펠 릿으로 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 된 스냅인 ° c.</li>
</ol> 5. 쥡니다 <ol><li>핵 펠 릿 (기계와 dounce 이동할 위한 50 µ L)의 볼륨을 평가 하 고 포장된 핵 볼륨의 4 번을 3까지 쥡니다 버퍼에 resuspend sonicate sonicator는을 사용 하 여 4 ° C에서 10-15 분 . 
	참고:는 염색 질 (6) 아래 설명 된 대로 즉시 분석 또는 냉동 고 수-80에 저장 ° c.</li>
</ol> 6. 다음 쥡니다 Chromatin 조각 크기를 평가 참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>드 crosslink chromatin의 30 µ L 1.5 mL 테스트 튜브에 고 추가 20 µ L 5 M NaCl. 500 µ L 볼륨을 완료 하 고 65 ° C에서 밤새 품 어.
	<ol><li>다음 날 치료 1 µ L 성분 K (20 mg/mL 증권), 10 µ L 2 M Tris pH 6.8, 및 10 µ L 42 ° C. 수행 된 페 놀-클로 프롬/클로 프롬 추출에서 1 시간에 0.5 M EDTA의 수행 및 나트륨 acetat의 1 볼륨 DNA를 침전 한 시간 또는 하룻밤-20-80 ° C에서 100% 에탄올의 e (3 M) 및 2 ° c.</li>
	</ol></li> <li>15 분 Decant는 상쾌한 13500 x g에서 원심 분리 하 여 DNA를 작은 찬 70% 에탄올과 5 분 Decant는 상쾌한에 다시 한번 원심 분리기로 깨끗이 펠 릿을 세척 하 고 건조는 펠 릿.</li>
	<li>테 버퍼의 원래 볼륨 (30 µ L)에 펠 릿을 resuspend. 260 nm/280 nm에서 흡 광도 분 광 광도 계에 DNA 농도 측정. 플라스틱 1.5 %agarose 젤의 별도 차선에 DNA 크기 사다리와 DNA의 500-1000은 고 chromatin의 조각 크기를 평가 하기 위해 전기 이동 법을 수행. 
	참고: 조각 크기 200-500의 기본적인 쌍 사이 여야 하 고 아무 감지 높은 분자량 조각 하 비-또는 저조한-조각화 DNA에 해당 되어야 합니다. Chromatin 솔루션 (5 단계)를 다시 긴 시간 sonicated 고 최적 크기를 얻을 때까지 위에서 설명한 대로 다시 분석 수 필요한 경우.</li>
</ol> 7. Chromatin Immunoprecipitation (칩) 참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
Aliquoting 1 mL에 에탄올 50% 슬러리의 의해 <ol><li>블록 단백질 G sepharose 구슬. 펠 릿은 벤치탑에서 1 분 400 x g에서 원심 분리 하 여 구슬 원심 400 x g에서 테 버퍼 원심 분리기의 1 mL로 씻어 고 반복 하는 워시
	<li>후 두 번째 원심 분리, 다시 칩 희석 버퍼 BSA (재고 20 mg/mL)의 25 µ L의 1 ml에서를 일시 중단 하 고 20 µ L 효 모 tRNA (재고 10 mg/mL) <ol>. 4 회전 (40-60 rpm) 하 여 적어도 2 사용 전에 h 구슬 차단 ° c.</li>
		<li>Chromatin (5 단계)의 희석 50 µ g 8 ~ 10 배 칩 희석 버퍼를 사용 하 여. 차단 된 비드 슬러리의 50 µ L을 추가 하 고 4에서 2 h (40-60 rpm) 회전에 대 한 품 어 ° C. 원심 분리기 사전 허가 chromatin 신선한 튜브 전송 하 4 ° C에 400 x g.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation에 대 한 1 차적인 항 체 (예, chromatin의 10 µ g 당 1-2 µ g)의 적절 한 금액을 추가 하 고 4 회전 밤새 품 어 ° c. 
	참고: 최적의 양의 항 체 공급 업체에서 권장 될 수 있습니다 또는 칩-정량 항 체의 다른 수량으로 최적의 농축 관찰 될 때까지 수행 하 여 실험적으로 결정 될 수 있다. 또한 단백질 G sepharose 사용 하는 항 체의 하위 형식에 따라 단백질 A sepharose에 의해 대체 될 수 있습니다.</li>
	<li>추가 차단된 구슬 다음날 고 4 회전 (40-60 rpm) 1 시간에 대 한 품 어 ° C. 원심 분리기 작은 구슬, 제거 하는 상쾌한 고 시작 칩 20-30 s 400g x 세척.</li>
	<li>세척 칩: 버퍼와 함께 다음 세척을 수행: 낮은 소금 버퍼, 한 번 그리고 높은 소금 버퍼를 두 번 LiCl 버퍼와 두 번 그리고 마지막으로 두 번 테 버퍼와.
	<ol><li>회전 (40-60 rpm) 4 ° C에서 10 분 동안 각 세척을 수행 하 고 작은 벤치 가기 원심 분리기에서 20-30 s 400g x에서 원심 분리 하 여 각 씻어 사이의 구슬.</li>
	</ol></li> <li>차입에 대 한 마지막 세척 제거 하 고 동요 하는 동안 실 온에서 15 분 동안 250 µ L 차입 버퍼 (갓 준비) 구슬 resuspend.</li>
	<li>원심 분리기 g 및 수집 신선한 튜브 eluate x 400. 이 단계를 두 번 및 다음 드 crosslink 20 µ L NaCl 5 M 및 1 µ L RNase A와 하룻밤 eluate 수행 (10mg/mL), 가수분해, K와 페 놀-클로 프롬/클로 프롬 extr 치료단계 6 행동.</li>
	<li>테 버퍼의 50 µ L에서 resuspend를 사용 하 여 aliquots 칩 정량에 대 한 표준 프로토콜 15 당 칩의 품질을 확인.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq.">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li><li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAF4,+a+subunit+of+transcription+factor+II+D,+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation.">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613 (2014).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells.">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530 (2010).</li><li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington's+disease+mice.">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li><li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo.">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기는 성인 마우스 골격 근육이 염색이 질은 근육 섬유 핵 녹음 방송 요인 바인딩 및 화학식 히스톤 수정을 감지 칩 실험에 적합 표시에서 chromatin를 준비 하기 위한 새로운 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요 한 단계가 포함 됩니다. 첫 번째는 조직 장애 dounce 또는 기계적인 전단에 의해 수행 될 수 있는. 기계적 전단 빠르고 더 재현 이며 따라서 방법의 선택. 그럼에도 불구 ?...

Chromatin immunoprecipitation (칩) 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 결합 하 고 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq) 전사를 공부 하는 선택의 방법 및 다양 한 조직에서 유전자 발현의 후 성적인 규정 되 그리고 세포 유형1. 이 기술은 화학식 chromatin 수정, 히스톤 변형 인, 및 녹음 방송 요인 바인딩2,3의 프로 파일링 게놈 넓은 수 있습니다.
배양된 세포에서 칩을 수행 하는 것이 잘 설립 동안 포유류 조직에서 칩 더 도전 남아 있다. Chromatin 칩에 대 한 준비 하 고 모든 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 하는 데 필요한 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. Chromatin는 경작된 한 세포의 세포 lysates 또는 그들의 핵의 다음 정화에서 준비 될 수 있습니다. 포유류 직물의 경우 효율적인 세포, 포름알데히드 고정, 그리고 핵의 정화는 chromatin의 복구를 보장 하기 위해 중요 하다. 또한, 그들의 정화 전후 핵 해결을 선택 실험적으로 결정 될 수 있다. 이러한 장애물에도 불구 하 고 칩은 간, 고환, 또는 뇌4,,56같은 조직에서 성공적으로 수행 되었습니다. 골격 근육의 경우 같은 물리적으로 저항 조직, 구조 단백질의 높은 콘텐츠 및 그것의 핵의 절연 전시 중단은 특히 도전적 이다. 이 특이성을 감안할 때, 다른 조직에 대 한 최적화 된 프로토콜 주지 않는다 만족 스러운 결과 골격 근육에 대 한.
여기는 칩-학년 chromatin 물리적 조직, 포름알데히드 고정, 그리고 핵 및 쥡니다의 방해를 포함 하는 마우스 골격 근육 조직에서 분리 하는 프로토콜에 설명 합니다. 염색 질이이 조직에서 적합 한 칩에 대 한 준비를이 방법의 효율성은 다양 한 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정7칩 정량 및 칩 seq를 수행 하 여 시연 했다.
이 새로운 기술은 이전에 보고 된 프로토콜8 시간, 녹음 방송 요인의 게놈 현지화에 변화 하는 동안 오래 콜라 소화 단계를 구성 보다 훨씬 빠른 고 유전자 발현에 변경 자리를 차지할 수 있습니다. 핵은 분리 하 고 고정 속도 여기에 설명 된 메서드를 특히 매력적인 chromatin 네이티브 게놈 인 상태를 더 충실 하 게 준비 하 게 만듭니다. 또한, 비록 근육 조직에서 chromatin 격리 또는 단백질 추출에 대 한 다른 방법 설명된8,,910 되었고 선택 된 유전자, 아니 칩 seq에 칩 정량 실험을 위해 사용 그들을 사용 하 여 데이터 보고 되었습니다. 여기 보고 메서드는 전사 인자와 히스톤 수정 칩 seq에 적합 하 고 따라서 또한 적합 해야한다 3/4 C 또는 HiC chromatin 구조 캡처 응용 프로그램.

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose beads</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde EM grade</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>yeast tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Blue</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Antibody</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Antibody</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Focused Ultrasonicator</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m and 40 &amp;mu;m cell strainers (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

우리는 성인 마우스 골격 근육, 구조 단백질의 높은 내용 가진 물리적으로 저항 조직에서에서 chromatin의 준비에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 성인 쥐에서 해 부 다리 근육은 육체적으로 기계 이동할 또는 닦지 세포 lysate의 포름알데히드 고정 하기 전에 당뇨 버퍼에 douncing의 조합에 의해 중단 됩니다. 고정된 핵 더 사이클 기계 이동할 또는 douncing 및 순차 filtrations 세포 파편을 제거 하 여 정화 됩니다. 순화 핵 동결 후 즉시 또는 나중에 무대에서 sonicated 수 수 있습니다. chromatin를 효율적으로 sonicated 수 있습니다 그리고는 프로필에서 볼 수 있듯이 chromatin immunoprecipitation 실험에 적합 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정에 대 한. 이 프로토콜에 의해 준비 하는 chromatin를 사용 하 여 검출 바인딩 이벤트는 주로 다른 섬유 관련 위성 및 내 피 세포에서 chromatin의 존재에도 불구 하 고 근육 섬유 핵에서 그. 이 프로토콜은 따라서 성인 쥐 골격 근육에 있는 유전자 규칙을 공부에 적응.

핵을, 우리는 15 또는 45 s, 18000 및 22, 000 rpm ( 재료의 표참조)에 대 한 해 부와 다진 근육 조직의 기계적 균질 수행. 모든 조건에서 핵에서 조직, 분리 될 수 있었다 하지만 수익률은 낮은 속도 (그림 1A-B)를 사용 하 여 최적의. Douncing 3-5 분 (그림 1A및 데이터 표시 되지 않음), 핵 수 또한 준비 하지만 기계적 ...

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K 조회수.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. 염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

연구

유전학

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

생화학

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Satellite Cell from Mouse Limb Muscles and Flow Cytometry Analysis (마우스 사지 근육에서 위성 세포 분리 및 유세포 분석)

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

저자 스포트라이트: 마우스 근육 줄기 세포의 Cistrome 분석 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&amp;RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

발생학

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

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마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

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포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

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초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석