이 프로토콜은 높은 재현성과 속도 및 낮은 부피를 가진 핵산을 캡슐화한 지질 나노 입자를 생성하는 데 사용될 수 있다. 제형 파라미터는 임상 적용에 기초하여 원하는 바이오 분포를 달성하기 위해 튜닝될 수 있다. 미세 유체 카트리지의 표준 헤링본 설계는 혼합 중에 빠르고 정밀하며 제어된 라미나르 흐름을 허용합니다.
이 방법은 확장이 가능하며 균일하고 캡슐화된 입자를 생성할 수 있습니다. 대부분의 상업적으로 승인된 유전자 치료 제품이 바이러스 방법에 의존하므로, 이 절차는 유전자 전달에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 비 바이러스 접근법은 반복 투약이 필요한 응용 프로그램을 허용하므로 가능합니다. 간헐적인 소용돌이가 있는 유리 바이알에 각 액체 스톡 용액의 적정량을 첨가하여 시작합니다.
표에 표시된 바와 같이, 533 마이크로리터의 최종 부피에 200 개의 증거 에탄올을 첨가합니다. 그런 다음 적절한 양의 mRNA 스톡을 추가하고 구연산 버퍼로 희석하여 원하는 농도에서 1.5 밀리리터의 최종 부피를 달성한다. 미세 유체 채널을 프라임하려면 먼저 표에 설명된 대로 프라이밍 매개 변수를 계측기 소프트웨어에 입력합니다.
그런 다음 기기 뚜껑을 열고 미세 유체 카트리지를 회전 블록에 배치합니다. 적어도 500 마이크로리터의 에탄올을 1 밀리리터 주사기에 적재하고 주사기 끝에 거품이나 공기 간격이 없다는 것을 돌보고 주사기를 카트리지의 오른쪽 입구에 삽입합니다. 5 밀리리터 주사기를 1.5 밀리리터의 구산완충제로 적재하고 기포나 틈새가 없는 지 주사기를 카트리지의 왼쪽 입구에 삽입합니다.
클립 홀더에 15밀리리터 원컬 튜브 2개를 넣고 폐기물 용기역할을 하고 Go"를 클릭하여 솔루션을 혼합합니다. 아래 파란색 표시등이 차단된 대로 프라이밍을 중지하면 늦게 열리고 원문 튜브와 주사기를 적절히 폐기합니다. 지질 나노 입자 형성의 경우, 테이블에 표시된 대로 적절한 제형 매개 변수를 설정하고 이전에 준비된 지질 혼합물로 1 밀리리터 주사기를 적재한다.
주사기 팁의 공기 간격이나 거품을 제거하고 주사기를 카트리지의 오른쪽에 삽입합니다. 이전에 준비된 핵산 용액을 3 밀리리터 주사기에 적재하고 주사기 팁에 거품이나 공기 갭이 없다는 것을 돌보고, 주사기를 카트리지의 왼쪽 입구에 삽입합니다. 샘플 이름이 표시된 15 밀리리터 RNAase 프리 원칼 튜브를 왼쪽 튜브 클립에 넣고 오른쪽 튜브 클립에 15 밀리리터 폐기물 원원형튜브를 배치합니다.
기기 뚜껑을 닫고 Go.the Go.lipid 및 mRNA 용액이 미세 유체 카트리지를 통해 흐르고 지질 나노 입자 용액은 원원 튜브에서 수집됩니다. 제형 공정의 끝에 원문 관을 유지한 다음, PBS와 생물학적 안전 캐비닛의 5밀리리터로 지질 나노입자를 희석시킵니다. 완충 교환을 수행하기 위해 먼저 PBS, 원심분리기 2밀리리터로 100킬로달톤 모공 크기의 초원심분리기 필터를 예세척한 다음 아래 칸에서 PBS를 비웁니다.
희석된 지질 나노입자를 3개의 원심분리기 세척에 미리 세척된 초원심분리기 필터의 상단 구획에 넣고, 흐름을 버리고 처음 두 번의 세척 후 초원심분리기 필터에 PBS의 5밀리리터를 추가한다. 마지막 세척 후, 초원심분리기의 벽에 대한 지질 나노입자 용액을 몇 번 피펫하여 나노입자 용액을 뉴클레아제 없는 유리알로 옮기기 전에 나노입자 손실을 최소화한다. 그런 다음 PBS를 추가하여 필요에 따라 나노 입자 현탁액을 적절한 실험 농도 및 부피에 가져옵니다.
지질 나노 입자의 캡슐화 효율을 평가하기 위해 먼저 PBS에서 작동하는 핵산 용액의 2배 연속 희석제를 제조하여 밀리리터당 500나노그램에서 시작하여 최소 5개의 희석제를 만드는 표준 곡선을 생성합니다. 다음으로, 표준 곡선의 중간점 주위에 놓여 있는 적절한 이론적 농도를 달성하기 위해 PBS에서 나노입자 시료 희석을 준비한다. 그런 다음 리보 그린 RNA 시약을 준비하여 적절한 양의 RNA 시약, 트리톤 X100 및 PBS를 혼합하여 지질 나노 입자의 내부 및 외부 RNA의 존재를 감지합니다.
이어서, 액체 나노입자 의 외부 RNA의 존재를 검출하기 위해, 적절한 양의 RNA 시약 및 PBS만 혼합한다. 적재는 핵산 표준 및 지질 나노 입자 용액을 검은 형광 가능 96 웰 플레이트로 복제한 다음, 표준 및 샘플 복제에 트리톤 X100을 사용하여 동일한 양의 RNA 정량화 시약을 첨가합니다. 샘플의 철저한 혼합을 얻기 위해 빛으로부터 보호실온에서 5 분 동안 플레이트 판독기의 플레이트를 흔들어 샘플을 철저히 혼합한 다음 480 나노미터의 난사 파장 및 520 나노미터의 방출 파장에서 마이크로 플레이트 판독기의 형광을 측정합니다.
지질 나노 입자의 유체 역학 적 크기와 폴리 분산도를 측정하기 위해 먼저 PBS에서 나노 입자 용액을 40 번 희석하고 세미 마이크로 큐벳에 용액을 추가합니다. 큐벳을 제타제기에 적재하고 표준 작동 절차를 선택하여 재료, 분산제, 온도 및 세포 유형에 따라 나노 입자를 측정하도록 계측기를 설정합니다. 그런 다음 시작"을 클릭하여 지질 나노 입자의 유체 역학 크기와 다중 분산성을 측정합니다.
지질 나노 입자의 제타 전위를 측정하기 위해 핵이없는 물에서 나노 입자 용액을 40 번 희석하고 용액을 충진 선에 큐벳으로 로드합니다. 전극이 계측기와 접촉하는 것을 주의하여 큐벳을 제타 전위 분석기로 적재하고, 지질 나노 입자의 특정 구성에 따라 제타 전위를 측정하는 계측기를 설정합니다. 그런 다음 시작"을 클릭하여 제타 지질 나노 입자 전위를 측정합니다.
본 분석에서, 동일한 지질 제제및 인산염 비에 아민을 가진 지질 나노입자의 다중 배치는 기술의 재현성을 입증하기 위해 별도의 날에 개발되었다. 관찰된 바와 같이, 일괄 처리는 1개와 2개의 부분이 유사한 폴리 분산증과 겹치는 크기 분포를 나타내었으며, 배치 간의 크기 또는 캡슐화 효율에서 관찰된 큰 차이가 없습니다. 전형적으로, 제형 파라미터의 변화는 일부 작지만 통계적으로 유의한 차이를 유도한다.
예를 들어, 인산염 비에 아민을 감소시키는 것은 캡슐화 효율이 4% 감소하며, 나노입자의 유체역학적 직경이 수반된다. 다른 이온화 성지질로 제조되었지만 인산염 비율에 동일한 아민으로 제조된 지질 나노 입자는 캡슐화 효율뿐만 아니라 입자 직경의 약간의 차이를 나타낸다. 플라스미드 DNA의 캡슐화는 지질 나노 입자를 캡슐화하는 mRA에 비해 더 큰 입자를 초래하지만, 나노 입자의 두 유형은 유사한 캡슐화 효율을 입증하지만.
그러나 유량 공정 파라미터의 변화는 지질 나노입자 개발에 영향을 미치지 않는다. 지질 나노 입자는 훌륭한 응용 프로그램을 가지고, 최근 승인 된 COVID-19 백신인 완벽한 예. 이 기술은 훌륭한 도구 세트 역할을하며 낮은 사지 제형 검사를 허용하여 향후 응용 프로그램을 위한 길을 열어줍니다.
