미세 유체는 튜닝 가능한 나노 입자 크기의 리포솜과 뛰어난 재현성과 확장성을 갖춘 새로운 기술입니다. 이 프로토콜은 독소루비신과 같은 화학요법 약물과 인도시아닌 그린과 같은 형광염과 공동 하역을 위해 저온 에민감한 리포솜의 연속 높은 출력 생산을 가능하게 한다. 세포 제제는 주로 지질 필름 수분 공급 및 압출과 같은 하향식 접근법을 사용합니다.
임상 응용 을 위해 크고 재현 가능한 배치를 준비하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 미세 유체의 주요 장점은 연속적이고 자동화된 방식으로 작동하면서 공간과 시간에 높은 제어력을 갖춘 작은 액체 부피를 처리하는 기능입니다. 캘빈 청과의 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 연구원인 광롱 마와 아말리아 루이스가 될 것입니다.
주사기 펌프를 조립하려면 펌프-펌프-펌프 네트워크 케이블을 사용하여 보조 주사기 펌프의 컴퓨터 포트에 연결하여 마스터 주사기 펌프의 네트워크 포트에 연결합니다. PC를 사용하여 네트워크 케이블을 펌핑하여 마스터 펌프의 컴퓨터 포트에 컴퓨터 의 RS-232 직렬 포트에 연결합니다. 사슴가드 헤링본 마이크로믹서 미세 유체 장치를 조립하려면 너트와 ferrule을 사용하여 튜브를 장치의 각 입구 및 콘센트에 연결합니다.
그런 다음 두 번째 너트와 페룰 및 조합 어셈블리를 사용하여 두 입구모두에 대한 튜브 터미널을 여성 루어로 변환합니다. 펌프 제어 소프트웨어를 설정하려면 주사기 펌프의 설치 버튼을 사용하여 마스터 주사기 펌프 및 보조 주사기 펌프의 주소를 각각 광고:01 및 Ad:02에 할당한 다음 컴퓨터에서 펌프 제어 소프트웨어를 엽니다. 두 개의 주사기 펌프를 자동으로 감지한 다음 비어핑 소리가 나아져야 합니다.
HSW Norm-Ject 5cc 직경은 12.45mm에 직경을 할당합니다. 펌프 1의 경우 분당 0.25 밀리리터와 펌프 2의 경우 분당 0.75 밀리리터로 속도를 설정합니다. 볼륨을 5밀리리터 이상의 값으로 설정하고 두 펌프모두에 대한 주입 모드를 선택합니다.
그런 다음 설정을 클릭하여 설정을 확인합니다. LTSL10 또는 LTSL10 ICG 지질 혼합물을 준비하려면 5밀리리터 루어 잠금 주사기를 사용하여 지질 혼합물 1밀리리터와 다른 5밀리리터 루어 잠금 주사기를 인출하여 최소 3밀리리터의 황산염 용액을 인출하십시오. 주사기의 배럴 플랜지를 펌프의 주사기 리테이너에 밀어 주사기 펌프에 장착된 주사기를 똑바로 세워 펌프의 푸셔 블록에 부착하고 가열 테이프의 다른 끝을 시레팅 주위의 온도 프로브와 함께 감싸는 립을 포함한다.
가열 테이프의 끝을 수액용액을 함유하는 주사기에 감싸고, 지질 혼합물을 함유한 주사기를 에탄올 입구에 연결하고, 수성 입구에 황산염 용액을 함유한 주사기를 수성 입구에 연결한다. 플런저 위치를 조정하여 필요에 따라 주사기에서 기포를 제거하고 주사기의 온도가 약 51도에 도달할 때까지 10초 간격으로 가열 테이프를 연결및 분리합니다. 온도 조절기가 적절한 온도를 표시하면 펌프 제어 소프트웨어의 모든 실행을 클릭하여 주사기 펌프를 실행하고 유체 흐름이 기포와 누출이 없는지 확인합니다.
리포솜 샘플을 유리병으로 수집하고 주사기가 거의 비어 있을 때 주입을 일시 중지하거나 중지합니다. 수집된 리포솜 용액을 1-1/2시간 동안 60도의 수조로 옮김한 후 투석튜브로 용액을 투석튜브로 옮기고 240밀리머암모늄 황산염을 섭씨 37도에서 최소 4시간 동안 투석할 수 있습니다. 그런 다음 정제 된 리포솜을 섭씨 4도에 보관하십시오.
막 판 pH 그라데이션에 의한 리포솜의 원격 적재를 위해, HBS의 25 밀리리터를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 상단에 로드하고 모든 용류가 컬럼을 통해 흐를 수 있도록 합니다. 투석된 리포솜 1밀리리터를 컬럼에 로드합니다. 모든 지질 용액이 컬럼을 통과하면 1.5 밀리리터의 신선한 HBS를 컬럼에 추가합니다.
모든 버퍼가 컬럼을 통과하면 3밀리리터의 신선한 HBS를 컬럼에 추가하고 용액을 수집합니다. 다음으로, DOX 용액을 1:20 DOX:인지질 어금니 비율로 Biju 바이알에 완충 교환 리포솜 용액의 1밀리리터에 추가하고 1-1/2 시간 동안 37도 섭씨 수조에 유리병을 배치합니다. 적재 후, 그냥 입증 된 크기 배제 크로마토그래피로 리포솜을 정화합니다.
레이저 가열 유도 된 방아쇠 방출의 리포솜 함량의 경우 수조를 섭씨 37도로 설정하십시오. 온도가 안정되면, 명확한 96 웰 플레이트의 각 우물에 DOX로드 리포솜의 200 마이크로 리터를 추가하고 바닥에 물에 잠긴 수조에 접시를 배치합니다. 그런 다음 레이저 시스템을 전류를 2.27 앰프로 설정하고 레이저 시스템 콜리메이터5센티미터를 96웰 플레이트 의 표면 위로 수직으로 배치합니다.
레이저를 켜고 광섬유 온도 프로브를 사용하여 분당 한 번 온도를 모니터링합니다. 5분 과 10분 만에 명확한 96웰 플레이트의 각 웰에서 DOX 장전 된 리포솜 10 마이크로리터를 흡면하고 190 마이크로리터의 HBS를 블랙 96웰 플레이트의 3개의 개별 우물에 추가합니다. 완전한 약물 방출을 평가하기 위해 리포솜 10 마이크로리터와 HBS 170 마이크로리터, 1%트리톤 X-100 세제 용액 20개에 블랙 96웰 플레이트의 3개의 개별 우물을 혼합합니다.
그런 다음 플레이트 판독기에서 DOX 형광 강도를 측정합니다. LTSL4의 미세유체 생산은 LTSL10의 제조가 명확한 비점성 액체의 형성을 초래하는 동안 많은 수의 갇힌 기포에 의해 도시된 젤과 같은 점성 용액을 초래한다. 섭씨 51도에서 제조된 LTSL10의 동적 광 산란 측정은 실험의 성공을 나타내는 예상되는 Z 평균 직경과 분산성을 보여줍니다.
그러나 LTSL10이 섭씨 20도에서 제조되면 더 크고 분산된 리포솜이 얻어져 최적이 아니다. 기존의 지질막 수화 방법에 의해 제조된 LTSLs는 50-80%의 DOX 캡슐화 효율을 입증하고, 미세유체에 의해 제조된 LTSL10은 DOX 캡슐화 효율을 평균 85%로 크게 증가시켜 DOX의 원격 로딩의 성공과 측막 의 존재를 나타낸다. LTSL10의 DOX 방출 프로파일은 온도에 민감한 것으로 결정되었습니다.
LTSL10은 섭씨 42.6도에서 최고기온이 최고조에 달하는 섭씨 41.6도에서 발병하여 비교적 광범위한 위상 전환을 하고 있습니다. ICG 하중의 효율은 초기 ICG 농도 및 샘플의 크기와 분산성에 따라 달라집니다. 또한, 근적외선 레이저를 이용한 LTSL10 ICG 조사는 DOX의 방출을 유발하는 광열 가열을 유도한다.
이 절차를 시도할 때, 액체의 혼합 및 따라서 리포솜의 형성이 재현 가능한 남아 있도록 안정적인 유체 흐름을 보장하는 것이 중요합니다. 리포솜 어닐링 및 투석은 높은 로딩 용량을 갖춘 안정적인 리포솜 제형을 보장하기 위한 두 가지 중요한 단계입니다. 생체 내 시험은 또한 LTSL10 바이오 분배, 약물 방출 및 항암 활성을 평가하기 위해 수행될 수 있다.
우리의 프로토콜은 약물 전달 응용 프로그램에 대한 콜레스테롤프리 리솔지립함유 열민감성 리포솜의 성공적인 미세유체 생산에 사용될 수 있습니다.
