우리는 microjetting 매개 변수에 대한 조언 버클리 캘리포니아 대학의 플레처 연구소에서 마이크 Vahey 감사합니다. 이 작품은 NIH 보조금 HL117748 DP2-01가 후원했다.

1. 무한 상공 회의소 제작 <ol><li> 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 (모양의 이름을 딴) 무한대 실을 디자인하고, 레이저 커터와 호환되도록 파일을 저장합니다. 레이저 커터와 투명 아크릴에 1/8- 3 / 16에서 실을 잘라 인치 0.15의 중심 간 거리를이 모양, 직경 0.183의 분리 된 두 개의 원을 만들 수 있습니다. 무한대 모양이 물방울 인터페이스 이중층의 형성과 안정성을 용이하게한다. </li><li> 무한 형 웰에 아크릴 챔버의 에지를 통해 1 / 16에서 구멍을 드릴. 반대편에 반복합니다. 가위로 0.2 mm의 아크릴 시트 또는 우물 바닥 역할을 레이저 커터에서 작은 사각형을 잘라. </li><li> 0.2 mm 아크릴 한쪽 속건성 접착제의 얇은하지만 완전한 층을 적용하고 상기 챔버의 하부에 접착제. 챔버의 바닥에 단단히 자리에 0.2 mm의 아크릴을 잡고 분배접착제는 밀봉을 생성하지만, 가시 영역을 커버하는 방지 할 수 있도록하는 인터페이스에서의 접착제. 가장자리가 챔버 벽의 가장자리에 닿을 때와 완전히 무한대 실 컷 아웃을 덮도록 아크릴을 정렬해야합니다. 이것은 충분한 제트 침투를 허용하고 잘의 누출을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 드릴 구멍을 커버하는 천연 고무의 두 개의 작은 조각을 잘라. 구멍 주위 속건성 접착제를 적용합니다. 고정 집게 한 쌍의 모든 영역에 구멍을 누릅니다에 고무를 배치합니다. 두 드릴 구멍을 반복합니다. 누출을 방지하기 위해 모든 접착 연결이 완료 밀봉되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 바늘 (23) G, 1을 사용하여, 압전 잉크젯 팁의 삽입을 용이하게하기 위해 챔버의 양면에 천연 고무에 구멍을 찌를. </li></ol> 2. 실험 준비 -20 ° C 냉동고에 클로로포름 매장 재고 지질 솔루션입니다. 본 연구의 경우, 1,2 - diphytano 하나일-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DPhPC) 1,2-dioleoyl-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DOPC)을 사용 하였다. 2 ㎖의 25 ㎎ / ㎖ 지질 솔루션은 일반적으로이 프로토콜에 준비하고 -20 ℃에서 저장 될 때 두 달 동안 지속됩니다 <ol><li> N-데칸의 지질을 재현 탁하려면 먼저 작은 유리 항아리에 재고 유리 병에서 전송하고, 아르곤, 질소 하에서 부드럽게 건조. 지질 빨리 건조 할 수 있도록 가스 자세히 표면적을 노출하면서 건조 각도 항아리 잡아. </li><li> 약간에 나사 항아리의 뚜껑으로, 건조 된 솔루션은 1 ~ 2 시간 동안 건조기 진공 아래에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음 25 ㎎ / ㎖에서 지질을 resolubilize하려면 n-데칸을 추가합니다. 소용돌이 지질 솔루션 짧게 15 분 동안 목욕 초음파 분쇄기에 초음파 처리. -20 ℃에서 N-데칸의 재구성 지질을 저장 </li><li> 주식 자당 솔루션을 준비합니다. 1.5 ML microcentrifuge 관에 300 밀리미터 자당의 900 μL, 100 μL를 추가1 % 메틸 셀룰로오스 (MC)의. 메틸 셀룰로오스는 분사에 도움 용액의 점도를 증가 추가됩니다. 선택 단계 : 각각 이미지에 더 많은 대비 또는 형광을 빌려 어두운 색의 식품 염료 또는 형광 구슬의 선택 1 μl를 추가합니다. 이 용액은 세포 삼투압 일치하고 microjetting 중에 콘트라스트를 제공하도록 설계 300 mOsm 자당 용액이다. </li><li> 일회용 1 ㎖ 플라스틱 주사기로 솔루션을 그립니다. 끝이 위쪽으로 향하도록 주사기를 들고 있지만, 끝을 향해 모든 거품을 추방하기 위해 반복적으로 샤프트를 가볍게하고, 갇힌 공기를 배출하는 플런저를 밀어 넣습니다. 이 분사에 대한 책임 적절한 압전 수축을 방해하므로, 진행하기 전에 주사기에서 모든 공기를 대피해야합니다. </li><li> 주사기의 단부에 0.22 ㎛의 필터를 설치. 필터에 포집되는 공기를 방지하기 위해 수직으로 주사기를 잡고 물방울이 팁 위에 형성 될 때까지 플런저를 밀어 넣습니다. 참고 :33mm 직경의 주사기 필터 유닛은 가장 잘 작동하는 것으로 확인되었지만, 3mm 직경 주사기 필터의 소형 대체 필터는 데드 볼륨을 줄이기 위해 사용될 수있다. </li><li> 잉크젯의 여성 루어 어댑터를 풉니 다, 안전하게 필터의 말을 통해 장소에 키를 누릅니다. 또, 공기를 포집 방지하기 위해 유체를 꺼냅니다. 잉크젯의 상단에 고정합니다. 그것은 완전히 부착 한 후 유체는 잉크젯의 끝을 이동해야합니다. </li></ol> 3. 장비를 준비하고 <ol><li> V-클램프를 사용하여, 현미경 스테이지 주사기 장착 조립체. 잉크젯 컨트롤러에 잉크젯에서 와이어를 연결합니다. 참고 : 지정 단계는이 프로토콜에 대한 지어진; 스테이지 디자인이 사용자에 의해 결정될 수 있지만, 주사기 및 샘플 홀더의 XY 제어 독립적 XYZ 컨트롤을하는 것이 중요하다. </li><li> 원하는 영상을 달성하기 위해 확대하고 필요한 렌즈의 조합을 결정합니다. 여기에 10 배 목표와 10 배의 접안 렌즈가 사용됩니다. </li&gt; <li> 분사 및 소포 생성을 시각화하기 위해 고속 카메라 (≥ 1,000 fps)를 사용합니다. 이전 영상에 필요한 카메라 보정을 수행합니다. 이미지 캡처를 시작하기 위해 카메라 소프트웨어 내에서 이미지 기반의 자동 트리거를 사용합니다. </li><li> 현미경 무대에 무한 챔버를 탑재합니다. 무대에서 제자리에 테이핑에 의해 챔버를 고정합니다. </li><li> 조심스럽게 천연 고무에 구멍 구멍 (그림 1b 참조) 잉크젯 끝을 맞 춥니 다. 이렇게하려면 챔버에 가까운 잉크젯을 가져와 눈에 의해 위치를 조정하려면 다음 현미경 렌즈를 통해보다 정확한 조정. 거친 움직임 잉크젯 팁을 손상시킬 수 있으므로, 조심스럽게 진행합니다. </li><li> 잉크젯가 정렬되면, 웰의 로딩 중에 잉크젯 손상을 방지하기 위하여 멀리 챔버로부터 주사기 조립체 백. 이 막에있는 구멍과 정렬 유지되도록 잉크젯의 움직임은 단방향 있는지 확인합니다. </li><li> plun에 부드럽게 누르십시오잉크젯 노즐의 작은 액적 형성 될 때까지 주사기 조립체의 GER. 이것은 몇 가지 초기 배압을 제공 할 것입니다. </li><li> 입력 분사 매개 변수를 설정합니다. 사다리꼴 바이폴라 파 들어, 다음과 같은 매개 변수 사용 : 20 kHz의 펄스 주파수 3 마이크로 초 상승 시간, 35 마이크로 초 펄스 지속 시간, 3 μsec는 하강 시간, 65 V의인가 전압 (펄스 진폭) 및 트리거 당 100 분사 펄스 (펄스 수) . 그러나,인가 전압 (펄스 진폭)과 펄스 수 (트리거 당 분사 펄스) 소포 크기를 제어하기 위해 변할 수있다. </li></ol> 4. 소포 세대 <ol><li> 두 우물의 전체 표면을 덮고, 무한대 실에 N-데칸에 현탁 25 ~ 30 ㎕의 지질 솔루션을 추가합니다. </li><li> 잘 하나, 피펫 천천히 부드럽게의 바깥 쪽 가장자리 (자당 솔루션과 같은 삼투압의) 25 μL의 포도당을 추가합니다. 포도당 및 지질 용액을 혼합하지 않기 때문에, 성막시, 글루코오스 방울 형성​​한다. 추가 다른 251, 또 다른 배달을 5 ~ 10 분 이내에 챔버의 중앙에있는 지질 이중층 막을 형성 할 것이다 반대 아니라, 포도당의 L. </li><li> 천연 고무를 통해 잉크젯를 삽입하고 조심스럽게 방울 인터페이스 이중층을 향해 안내합니다. 소개 잉크젯 볼륨을 치환하고 이중층 파열 수, 천천히 이중층 접근. </li><li> 잉크젯 ~ 200 ㎛ 이내 인 경우, 단계 3.8에 설명 된 설정을 사용하여 분사를 적용합니다. 이중층에서의 거리가 다른 매개 변수들 사이의 전압 펄스 수에 따라 주로 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 천천히 설정 (전압 펄스 수)을 증가시키고, 이중층의 변형을 관찰하는 것이 좋습니다. </li></ol> 5. 장비를 청소 <ol><li> 현미경 단계에서 주사기 어셈블리를 분리하고, 1 ㎖의 플라스틱 주사기 필터 처리. </li><li> 잉크젯을 청소하려면 solutio의 끝을 찍기 위해 다음과 같은 솔루션을 대기음N 7 배 각 : 따뜻한 물, 70 % 에탄올 및 DDH 2 O.에서 70 % 에탄올, 2 % Neutrad 솔루션 잉크젯 흡인 피펫에 안전하게 맞지 않으면 어댑터를 형성하기 위해 피펫 팁을 잘라. </li><li> 티슈로 챔버를 건조. 5 ~ 10 분 동안 2 % V / V의 따뜻한 물에 Neutrad 및 초음파 처리와 함께 250 ㎖의 비이커에 무한대 실을 배치합니다. 초음파 후, 철저하게 압축 공기에서 우물을 건조. 웰에있는 습기는 지질 이중층 막 안정성을 손상시킬 수 있으므로, 또한 챔버가 15 분 동안 60 ° C의 오븐에서 배치되는 것이 추천된다. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

대부분의 기술은 electroformation, 에멀젼, 비말 세대 14-16를 포함, 소포 생성을 위해 개발되었다. 그러나 새로운 실험 기술은 생명체에 성장 유사성 생물학적 시스템의 설계를 허용 할 필요합니다. 특히 미세 유체 방법은 가까운 생물학 소포 모델을 가져, 막 unilamellarity 크기의 단 분산, 내부 내용 (17, 18)을 관리하는 컨트롤의 증가 수준을 제안했다. 또한, 미세 유체 분사를 사용하여 특...

<html> 그것은 세포 생물학은 분자에서 세포에 대한 우리의 이해를 통합 포함하는 멀티 스케일의 문제가 점점 명백 해졌다. 따라서, 분자가 개별적으로 작동하는 방법을 정확하게 아는 것은 복잡한 세포의 행동을 이해하는 것만으로는 충분하지 않습니다. 이것은 5를 추출 Xenopus의 지질 이중층 소포 4, 유사 분열 스핀들 어셈블리와 액틴 네트워크 상호 작용의 재구성에 의해 예시 된 바와 같이, 부분적으로 다 성분 시스템의 긴급 행동이 존재하는 것이며, 세균 세포 분열 기계 (6)의 공간적 역학. 생명체의 분자 프로세스를 해부의 환원의 접근 방식을 보완하는 방법 중 하나는 생물학적 최소 구성 요소를 사용하여 세포의 행동을 재구성의 반대 접근을하는 것입니다. 이 방법의 중요한 부분은 제한된 양의 생체 분자의 믿을 수있는 캡슐, 세포의 핵심 기능을 포함한다. e_content &quot;&gt; 여러 가지 전략이 생체 모방 시스템을 공부 생체 분자를 캡슐화 존재한다. 가장 생물학적으로 관련 시스템이 세포의 세포막에 의해 부과 된 생화학 적 및 물리적 제약을 모방. electroformation 7로 거대한 단일 층 소포 (GUVs)의 형성 지질 이중층 막이다, 정제 된 단백질 작업에 문제가 될 수 GUV 세대 14에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는, 일반적으로 높은 소금 버퍼 (8)과의 비 호환성으로 인해 가난한 캡슐화 수율을 가지고 있습니다. Electroformation 또한 많은 양의 샘플이 필요합니다 (&gt; 100 μL), , 비효율적 근접한 지질 층 사이 확산의 어려움으로 인해 큰 분자를 포함한다. 지질 소포를 생성하기위한 여러 가지 미세 유체 접근 방식. W / O (레이어 물 - 기름 - 물 사이에 두 개의 인터페이스를 통해 구성 요소를 전달하는 이중 에멀젼 방법을 개발 한 / W), 할머니의 증발에 의존지질 이중층 형성 9를 구동 할 latile 용매. 기타 지질 이중층 소포 (10) 또는 두 개의 독립적 인 단계 (11)에서의 연속적인 스트림을 생성 미세 조립 라인을 사용했다. 우리는 빠르게 조절 크기, 조성, 및 캡슐화 GUVs 생산하는 액적 인터페이스 이중층 (12)에 대해 유체 펄스를인가에 기초하여 대안적인 기술을 개발했다. 미세 유체 분사로 알려진 우리의 접근 방식은 생물학적 다양한 문제를 조사하는 기능 생체 분자 시스템을 만들기위한 접근 방식을 제공, 기존의 여러 소포 세대​​ 기술의 결합 된 이점을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:633px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:160px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Piezoelectric Inkjet</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">MJ-AL-01-xxx</td>
			<td style="width:160px;">xxx denotes orifice diameter in microns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Jet Drive III Controller</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">CT-M3-02</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">High-speed camera</td>
			<td style="width:163px;">Vision Research</td>
			<td style="width:157px;">MiroEX2</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">DPhPC lipid in chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:157px;">850356C</td>
			<td style="width:160px;">Ordered in small aliquots in vials</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">33mm PVDF filters, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">1ml syringes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">14823434</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">n-Decane</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">111871000</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">410950010</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7903-1KG</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9084958</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:153px;">1/8&#34; Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">8560K239</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">0.2 mm Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">Astra Products</td>
			<td style="width:157px;">Clarex clear 001</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Acrylic Cement</td>
			<td style="width:163px;">TAP Plastics</td>
			<td style="width:157px;">10693</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Loctite 495 Superglue</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9011323</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive</td>
			<td style="width:163px;">Strobels Supply</td>
			<td style="width:157px;">30765</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Natural rubber</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">85995K14</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Custom stage</td>
			<td style="width:163px;">Home made</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs are available upon request</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer vesicle generation using microfluidic jetting

상향식 합성 생물학은 잠재적 생화학 시스템과, 최소한의 생물을 조사하고 재구성을위한 새로운 접근 방식을 제시한다. 이 새로운 필드는 아래에서 위로 복잡한 작동 시스템에 기본적인 생물학적 구성 요소를 설계하고 조립하는 엔지니어, 화학자, 생물 학자, 물리학을 결합한다. 이러한 상향식 (bottom-up) 시스템은 기본적인 생물학적 문의 및 혁신적인 치료 1,2 인공 세포의 개발로 이어질 수 있습니다. 거대한 단일 층 소포 (GUVs는) 때문에 자신의 세포와 같은 막 구조와 크기로 합성 생물학에 대한 모델의 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 미세 유체 분사 또는 microjetting는 제어 크기, 막 조성, 막 횡단 단백질 내장 한 캡슐 3 GUVs의 생성을 허용하는 기술이다. 이 방법의 기본 원리는 현탁 L 변형하는 압전 구동 잉크젯 장치에 의해 생성 된 다수의 고주파수 유체 펄스를 사용하는 것이다GUV에 IPID 이중층. 이 과정은 비누 필름에서 비누 거품을 불고에 가깝다. 분사 용액 감싸는 용액의 조성, 및 / 또는 구성 요소의 구성을 변화시킴으로써 이중층에 포함 연구자 받아서 소포를 만드는이 기술을 적용 할 수있다. 이 논문은 microjetting에 의해 물방울 인터페이스 이중층에서 간단한 소포를 생성하는 절차를 설명합니다.

우리는 기계 가공 부품 및 수동 마이크로 미터에서 조립 된 사용자 정의 단계 (그림 1)와 기존의 거꾸로 형광 현미경의 미세 유체 분사 설치를 조립했다. 잉크젯의 특성은 소포의 생성 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 잉크젯 노즐 및 지질 이중층 사이의 거리를 변화하는 힘이 멤브레인의 변형을 야기하기 위해 적용에 영향을 미친다. 이중층에 근접는 제트 기류 초점을 맞추고 멀리 ...

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Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K 조회수.  University of Michigan.  물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다. 

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

연구

생체공학

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

판막 다층 미세 유체 장치에 대한 여러 단계의 변수 높이 포토 리소그래피

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and Pfizer/BioNTech. These vaccines have demonstrated the efficacy of mRNA-LNP therapeutics and opened the door for future clinical applications. In mRNA-LNP systems, the LNPs serve as delivery platforms that protect the mRNA cargo from degradation by nucleases and mediate their intracellular delivery. The LNPs are typically composed of four components: an ionizable lipid, a phospholipid, cholesterol, and a lipid-anchored polyethylene glycol (PEG) conjugate (lipid-PEG). Here, LNPs encapsulating mRNA encoding firefly luciferase are formulated by microfluidic mixing of the organic phase containing LNP lipid components and the aqueous phase containing mRNA. These mRNA-LNPs are then tested in vitro to evaluate their transfection efficiency in HepG2 cells using a bioluminescent plate-based assay. Additionally, mRNA-LNPs are evaluated in vivo in C57BL/6 mice following an intravenous injection via the lateral tail vein. Whole-body bioluminescence imaging is performed by using an in vivo imaging system. Representative results are shown for the mRNA-LNP characteristics, their transfection efficiency in HepG2 cells, and the total luminescent flux in C57BL/6 mice.

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Here, a protocol for formulating lipid nanoparticles (LNPs) that encapsulate mRNA encoding firefly luciferase is presented. These LNPs were tested for their potency in vitro in HepG2 cells and in vivo in C57BL/6 mice.

미세유체 혼합으로 제조된 mRNA-지질 나노입자의 In vitro 및 In vivo 효율 테스트

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

조합 플러그 생산을 위한 미세유체 장치 설정

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

저자 스포트라이트: Integrating Computational and Experimental Approaches in Precision Oncology

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

조합 플러그 생산을 위한 이중층 미세유체 장치

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...