CNS 전이에 대한 새로운 치료법의 개발은 좋은 전임상 모델의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. 우리의 환자 유래 이종이식 모델은 역사적으로 사용된 세포주 모델보다 CNS 전이를 더 잘 요약합니다. 다양한 종양 접종 경로를 활용하여 전이성 캐스케이드의 다양한 측면을 연구할 수 있습니다.
각 경로에는 연구에 활용할 수 있는 이점이 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Ben Yi Tew가 될 것입니다. 냉동보존된 PDX 종양의 피하 측면 이식을 위해 섭씨 37도의 수조에서 냉동보존된 종양 조직을 신속하게 해동합니다.
그런 다음 조직 배양 접시에 5 밀리리터의 DPBS로 헹굽니다. 다음으로, 3-8 주 된 암컷 NOG 마우스에서 마취를 확인한 후 왼쪽 또는 오른쪽 측면에 0.5-1 센티미터 절개를하고 종양 조직의 2x2x2mm 조각을 주머니 깊숙이 삽입합니다. 절개 부위를 닫은 후 마우스가 보행이 될 때까지 모니터링하여 마취에서 회복되도록합니다.
종양이 자라기 시작하면 캘리퍼스로 일주일에 세 번 종양을 측정합니다. 적절한 실험 종점에서 부검을 통해 전이를 확인하고 조직학적 분석을 통해 표적 장기 내 종양의 존재를 확인합니다. 절제된 PDX 종양을 얼음 위의 DMEM에 놓습니다.
조직 배양 접시에서 5 밀리리터의 DPBS로 종양을 씻고 괴사 부위가있는 경우 제거하십시오. 종양을 2-4mm 길이의 작은 조각으로 자르고 조각을 해리 용액이 들어있는 튜브로 옮깁니다. Dissociator에서 적절한 프로그램을 사용하여 조직을 기계적으로 해리하고 생성 된 세포 현탁액을 70 마이크로 미터 세포 스트레이너를 통해 변형시킵니다.
20 밀리리터의 DMEM을 사용하여 스트레이너에서 남아있는 세포를 세척하고 해리 된 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 이어서, 세포를 재현탁시키고 DPBS를 계수하고, DPBS의 1 내지 2 마이크로리터 당 10 내지 4 세포의 농도를 5 내지 10배의 농도로 조정한다. 수술 부위를 준비하려면 쥐의 머리에 있는 털을 면도하여 두피를 노출시킵니다.
그런 다음 마우스를 정체 프레임에 넣고 이어 바를 사용하여 마우스 헤드를 단단히 고정합니다. 또한 적절한 진통제를 투여하십시오. 포비돈 요오드와 70 % 에탄올을 번갈아 가며 세 번 문질러 두피를 소독하십시오.
5-7mm 세로 절개를하여 두개골을 노출시키고 두피를 수축시킵니다. 집게로 골막을 긁어내어 브레그마를 찾습니다. 브레그마 위에 정위 프레임의 바늘을 놓고 좌표를 0으로 재설정합니다.
팔을 정중선의 오른쪽으로 1mm 뒤쪽과 1mm 옆으로 움직이고 영구 마커로 이 위치를 표시합니다. 그런 다음 뇌에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 표시된 위치의 두개골에 작은 버 구멍을 뚫습니다. 1 내지 2 마이크로리터의 세포가 있는 5 마이크로리터 26 게이지 해밀턴 주사기에 로딩하고, 주사기를 정위 암에 부착한다.
천천히 바늘을 뇌에 2 밀리미터 삽입하고 원하는 속도로 세포 주입을 시작하십시오. 모든 세포가 전달되면 바늘을 천천히 집어넣고 버 구멍을 뼈 왁스로 채우고 절개 부위를 닫습니다. 마취에서 회복될 때까지 모니터링하면서 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.
적절한 실험 종점에서 동물을 안락사시킨 후 조직 학적 분석을 통해 뇌의 종양 존재를 확인합니다. PDX 종양을 심장내 주사에 의해 이식하기 위해, 입증된 바와 같이 종양 세포를 준비하고, 마취된 수용자 마우스를 앙와위 자세에 놓는다. 동물의 가슴에 털을 면도하고 노출 된 피부를 포비돈 요오드와 70 % 에탄올로 소독하십시오.
0.5 내지 10 곱하기 10 내지 5 번째 종양 세포 및 최대 100 마이크로리터의 DPBS를 28 게이지 바늘이 장착된 주사기에 넣는다. 흉골 노치와 검상돌기 사이의 중간에 흉골의 약간 왼쪽에 주사 부위를 찾습니다. 그런 다음 주사 부위의 마우스에 바늘을 수직으로 삽입합니다.
바늘이 좌심실에 성공적으로 들어갔음을 나타내는 역류가 관찰되면 바늘을 움직이지 않고 종양 현탁액을 좌심실로 천천히 분배합니다. 모든 세포가 전달되면 천천히 수직으로 바늘을 집어 넣고 출혈이 멈출 때까지 약 1 분 동안 주사 부위에 멸균 거즈를 바릅니다. 마우스가 보행할 수 있을 때까지 모니터링과 함께 가열된 패드에서 마우스를 회복하도록 합니다.
적절한 실험 종점에서 부검을 통해 전이를 확인하고 조직학적 분석을 통해 표적 장기 내 종양의 존재를 확인합니다. 종양 미세 환경의 차이에도 불구하고 PDX 종양은 이식 부위에 관계없이 작은 핵과 부족한 세포질을 가진 세포를 포함하는 유사한 형태를 보여줍니다. 이 분석에서, 인간 흑색종 세포의 심장내 주사는 종양 세포의 마우스 뇌로의 전이를 초래한 반면, 뇌 전이 인간 소세포 폐암 종양 세포의 심장내 주사는 마우스 복강 및 간으로의 전이를 초래하였다.
이러한 프로토콜을 통해 새로운 치료법 및 치료 조합을 테스트하기 위한 전임상 연구를 설정할 수 있으며 생물학적 과정 및 종양 전이를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.
