오늘은 유충 제브라피쉬 PDX 모델을 소개할 예정입니다. 이 모델은 약물 반응을 평가하기 위해 xenograft에서 유사한 세포 조성을 더 잘 모방할 수 있고 또한 우리의 비교 분석을 가진 결과의 일관성을 더 향상하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점이 있습니다.
첫째, 다양한 표준 화학 염료를 사용하여 세포를 다른 형광으로 라벨링하여 세포 조성물의 실시간 추적과 분석 단계의 능력을 허용합니다. 둘째, 그것은 또한 제브라피시에 있는 인간 세포의 일반적인 생존 시간을 향상합니다, 그들의 유전자 수정, 약 시험을 위한 더 긴 관측 창을 제공합니다. 이 기술은 췌장암을 가진 환자를 위한 개인화한 약및 또한 전임상 종양 약의 사전 평가를 위한 잠재적인 모형을 제공합니다.
이 방법은 또한 생체 내의 제브라피시에 이식된 다른 종양 세포 또는 종양 세포 이종이없는 세포를 추적하고 더 긴 관찰 시간 동안 세포 생존을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 사출 플레이트를 준비하려면 E3 용액으로 1%의 아가로즈 50밀리리터 용액을 준비하십시오. 아가로즈가 녹을 때까지 용액을 끓입니다.
전체 용액을 10센티미터 페트리 접시에 붓고 Zebrafish 배아 고정 금형을 표면에 놓습니다. 아가로즈 용액이 완전히 고화되면 금형을 제거합니다. 주사 바늘을 준비하려면 바늘 풀러를 사용하여 10센티미터 유리 모세관을 내치인 0.9 밀리미터를 두 개의 바늘로 당깁니다.
현미경과 집게를 사용하여 바늘끝을 잘라 개구부를 만듭니다. 첫째, 성인 제브라피쉬 를 7~9시 경에 짝짓기 탱크에 1-2쌍의 성인 제브라피시를 넣습니다. 다음날 아침 8시에 수정란을 채취합니다. 수정란을 신선한 E3 용액 40밀리리터가 들어있는 페트리 접시에 옮기다.
섭씨 28.5도에서 배양하십시오. 먼저 수집된 췌장암 샘플을 페트리 접시에 옮기다. PBS로 조직을 5~6번 헹구고 메스를 사용하여 조직을 1밀리미터 큐브 조각으로 자른다.
다음으로, 파쇄된 조직을 5밀리리터의 HBSS를 포함하는 50 밀리리터 튜브로 옮기. 여기에 표시된 최종 농도에서 콜라게나아제 4형, 히알루로디나아제, DNAse를 추가합니다. 혼합물을 위아래로 피펫하여 잘 섞습니다.
15~20분 동안 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 37도의 감양으로 혼합물을 배양합니다. 혼합물을 5분마다 몇 번 위아래로 피펫합니다. 튜브에 DMEM의 7 밀리리터를 추가합니다.
원심분리기는 G 110회, 섭씨 4도에서 5분간. 이어서, 상체를 감소시키고 DMEM에서 종양 혼합물을 다시 중단한다. 혼합물을 그룹 1과 그룹 2라는 이름의 전체 성장 미디어의 3 밀리리터를 포함하는 두 개의 6센티미터 페트리 접시에 접시를 접시.
이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 두 그룹을 배양합니다. 48 시간 후에, 췌장암 섬유아세포의 100x 억제제를 그룹 1의 배지에 추가하여 자란 섬유아세포를 제거하고 암세포를 주요 세포 유형으로 남깁니다. 이전 조건을 사용하여 계속 인큐베이팅을 계속합니다.
렌티바이러스를 제조한 후, 세포를 30 내지 40% 밀도로 12웰 플레이트에 감염시종하였다. 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음 날, 밀리리터 당 8 마이크로 그램의 농도에서 폴리 브레인을 포함하는 혈청없는 매체의 500 마이크로 리터로 배지를 교체하십시오.
섭씨 37도에서 4시간 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그런 다음, 렌즈바이러스의 100 마이크로리터를 배지에 추가하고 12시간 동안 다시 배양한다. 12시간 후, 배지를 완전한 중간 크기의 2밀리리터로 교체하고 36시간 동안 인큐베이션을 추가로 사용할 수 있습니다.
36시간 후에형광 마커를 확인하십시오. 감염된 세포를 수확하고 밀리리터 당 백만 세포의 최종 농도와 일대일 비율로 혼합. 원심 분리는 5 분 동안 110 배 G에서 세포를 원심 분리하고 주입 용액의 50 마이크로 리터에서 세포 혼합물을 다시 중단합니다.
Zebrafish 애벌레를 마취한 후, 이를 수정된 E3로 채워진 주사판으로 옮기습니다. 혼합 세포 현탁액의 25 마이크로리터를 마이크로모세피 바늘에 넣고 바늘을 미세 주입 조작기에 삽입하십시오. 사출 압력과 시간을 설정하고 48 시간 후 수정 얼룩말 피시의 노른자 낭에 50 ~ 80 세포를 주입한다. 먼저, 제노이식 후 Zebrafish 애벌레를 섭씨 32도에서 40밀리리터의 혼합 용액으로 옮기습니다.
12웰 접시의 각 우물에 10개의 광이식 애벌레를 놓습니다. 다음으로 애벌레를 4개의 그룹으로 나눕니다. 대조군을 0.1%DMSO가 함유한 E3로 처리하고 다른 그룹을 젬시타빈 및/또는 Navitoclax로 처리합니다.
모든 애벌레를 섭씨 32도에서 이틀 동안 배양합니다. 제노이식 애벌레를 치료 후 마취한 후 3%의 메틸 셀룰로오스에 넣습니다. 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 측면 보기에서 애벌레를 이미지시하십시오.
그런 다음 이미지 J 및 그래프 패드 소프트웨어를 사용하여 빨간색 및 녹색 형광 신호의 강도를 정량화합니다. 이 연구에서, 1 차암 조직 세포는 췌장암 섬유아세포 억제제의 추가 없이 소화 후 완전한 배지로 종자된다. 암세포와 섬유아세포는 2개의 명백한 인구로 풍부하게 됩니다.
억제제가 없는 인구는 섬유아세포에 의해 지배되고 암세포 성장은 억제제를 첨가한 후에 우세합니다. BCL2L1에서 녹색 또는 빨간색 형광 단백질을 표현하는 두 개의 렌즈피바이러스 포장 벡터가 생성됩니다. 바이러스 기반 형광 라벨링은 세포의 생존 상태를 나타냅니다.
혼합 암세포와 섬유아세포는 수정 후 48시간 후에 Zebrafish 노른자 낭에 주입된 다음 젬시타빈 및/또는 Navitoclax로 2일 동안 치료됩니다. 제노이식의 상이한 인구 및 세포 조성에 있는 세포 vi책임은 약물 처리에 대한 응답으로 변경됩니다. 종양의 다른 모형을 처리할 때, 세포 소화 시간, 약 처리 복용량 등을 포함하여 반대될 필요가 있을 지도 모르다 몇몇 단계가 있습니다.
이 기술은 연구원이 표준 CGX 또는 PDS 분석에서 Zebrafish를 사용하는 데 도움이됩니다. 그것은 세포 성장에 그들을 비교하여 진행 대역을 정량화 고정 된 비율로 다른 세포의 혼합 및 주입을 허용합니다. 개인 보호는 특히 렌티 바이러스를 포장 할 때 큰 의미가 있습니다.
적절한 경우 마스크와 장갑을 착용하고 피부에 섞이지 않도록 노력하십시오.
