모델은 림프절과의 상호 작용을 통해 암 전이를 모방하는 데 일관되게 필요합니다. 방광의 대장암과 비뇨기과세포암 환자. 이 논문에 설명된 당사의 직교 성 신장 제뇨 모델은 이러한 중요한 생물학적 질문에 답하고 임상적으로 관련된 방식으로 새로운 치료법을 효율적이고 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.
마우스에서 생성된 우리의 치열토성 이종이이식 종양은 환자의 종양과 유사합니다. 림프절 기질 세포의 존재에서 두 모델 모두 더 높은 종양 이식 및 먼 장기 전이 속도 및 인간의 전이성 패턴을 모방 하는 위치. 또한 두 동물 모델 모두 절차 관련 사망률이 전혀 없습니다.
안락사 된 마우스에서 환자 파생 된 종양을 제거 한 후, 라미나르 흐름 후드 아래 페트리 접시에서 가능한 한 작은 루시포라기 루시포제균균 수술 가위를 사용합니다. 종양 조각을 멸균 50mL 원문 튜브로 옮기다. 다이제스트 용액을 준비하려면 콜라게나아제 형 4형 10mL, 히알루로니다제 80마이크로리터, 디옥시리보누셀리스 타입 1~40mL의 160마이크로리터를 HBSS의 1~40mL로 넣고 반전하여 혼합한다.
다진 종양에 35-40mL의 다이제스트 용액을 추가하고 주기적인 격렬한 흔들림으로 2 시간 동안 연속 회전으로 섭씨 37도에서 배양하십시오. 소화 후 이물질을 제거하기 위해, 멸균 100 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 소화된 종양을 걸러내고 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하여 매번 50mL 튜브로 흐름을 절약하고 이물질을 폐기한다. 무료 셀을 세척하려면 20mL의 HBSS를 329배의 중력으로 5분간 유량및 원심분리기에 추가합니다.
슈퍼나탈을 흡인시키고 30mL의 HBSS에서 펠릿을 재보아보세요. 멸균 15mL 원칼 튜브에 100, 000 종양 세포를 전송하고 이전에 준비된 신선한 HK 세포를 300, 000을 추가한다. 세포를 329배의 중력으로 5분간 원심분리하고 포부로 상퍼를 폐기한다.
완전한 RPMI 배지에서 세포를 다시 중단하고 사용할 준비가 될 때까지 얼음을 유지합니다. UCC 세포 주입에 대 한 동물을 준비 하려면 6-8 주 된 여성 NOD-SCID 마우스의 허리를 면도 하는 제 모 제 크림을 사용 하 여. UCC 세포를 방광으로 투여하려면 먼저 단극성 전기 코스터리 기계를 4와트의 전력으로 설정합니다.
마우스를 마취한 후, 주둥이가 이소플루란 코 콘에 주둥이로 스핀 위치에 놓고 분산된 전극에 단단히 접지된 맨뒤로 놓습니다. 윤활 젤리와 24 게이지 협안토테터를 윤활 한 다음 마우스 요도를 통해 부드럽게 하지만 단단히 앙미오카테터를 삽입합니다. 카테터가 진입시 구부러지면 가이드 와이어를 카테터에 중간쯤 삽입하여 안정성을 제공합니다.
그런 다음, 완전히 0.64 밀리미터 고정 코어 직선 가이드 와이어 를 삽입 1 앙미오카테터의 끝을 지나 밀리미터. 방광 점막의 전기 자극을 허용 1 초 동안 가이드 와이어에 단극성 핀을 개최. 신선한 멸균 협막증을 1 mL leur 잠금 주사기에 부착하고 이전 단계에서 준비된 UCC 세포의 최대 200 마이크로리터를 그립니다.
요도에서 가이드 와이어와 협심증을 제거한 다음 그것에 부착 된 세포의 주사기와 협경화를 삽입합니다. 마우스 방광에 세포의 50 마이크로 리터를 주입하고 세포가 방광 벽에 부착 할 수 있도록, 협심증을 제거하기 전에 몇 초 기다립니다. 마지막으로, 이소플루란 코 콘과 접지 패드에서 마우스를 제거하고 고민의 징후에 대한 절차에 따라 1 시간 동안 관찰.
CRC 마우스 모델을 만들려면, 미적 6-8주 된 남성 NOD-SCID 마우스를 해부 현미경으로 스누아웃및 이소플루란 코 콘 및 앞사지에 고정시켜 안정성을 위해 테이프로 놓습니다. 작은 거즈 섹션과 같은 작은 물체를 꼬리 의 밑에 놓아 항문의 상승하여 점성과 각도를 향상시킵니다. 곡선윤활무딘 기울어진 집게를 사용하여 항문 운하를 넓혀내고 탈모항점막과 직장 점막을 노출시키고 대변을 제거합니다.
멸균 30 게이지 탈착식 바늘을 50 마이크로리터 유리 주사기에 연결합니다. 주사기내로 이전 단계에서 제조된 종양 및 HK 세포 현탁액의 10 마이크로리터를 그립니다. 항문 운하 위의 1-2밀리미터 에 10 마이크로리터를 주입하여 골반 구멍으로 통과하지 않도록 하십시오.
마지막으로, 이소플루란 코 콘에서 마우스를 제거하고 고민의 징후에 대한 절차에 따라 1 시간 동안 관찰. 마우스 모델 중 에서 주중 종양, 간 및 폐 전이성 부담을 주간 모니터링하려면 먼저 마우스의 무게를 측정합니다. 150 mg/kg 루시페린 을 복상으로 주입하고 기판이 신체에서 순환할 때까지 5분을 기다립니다.
마취된 마우스를 코 콘에 고정된 코가 있는 생물 발광 이미징 시스템에 배치하여 동물의 복부 면인 관심 영역이 각 이미지에 대해 카메라를 향하고 있는지 확인합니다. 루시파아제 활성을 위해 매주 supine 위치에 있는 이미지 마우스. 파라핀에 내장된 고립된 조직을 슬라이스하고 염색한 후 고성능 현미경을 사용하여 관찰하십시오.
UCC 마우스 모형에서는, 동물의 83.3%는 1 차적인 종양을 생성하고 주간 생물 발광 측정에 근거를 둔 시간 의존적인 1 차적인 종양 성장을 표시했습니다. CRC 마우스 모델에서, 마우스의 96.9%는 1 차적인 종양을 성장했습니다. 환자 종양에 따라 마우스 종양 성장은 환자의 임상 적 특성의 차이를 반영하는 다른 대기 시간 기간을 가졌다.
소포 내 및 직장 내 모델 모두에서 종양 세포 주사발생 직교 1 차 종양. 더욱이, HK 세포를 가진 UCC 세포 및 CRC 세포로 주입된 마우스의 33.3%와 53.1%는 각각 먼 기관 전이를 개발했습니다. UCC 모형에 있는 xenografts의 조직 병리학은 1 차적인 참을성 있는 방광 암에 비교되었습니다.
xenografts에서 염색 결과는 유사한 조직 형태를 확인하는 원래 외과 생검에 있는 것과 유사했습니다. 인간 세포 증식 마커인 Ki67에 대한 항체는, 매우 확산되고 빠르게 성장하는 인간 종양 세포를 나타내는 양성 핵 염색을 나타낸다. 유사하게, CRC 모형에서, H&E 염색은 xenografts와 참을성 있는 종양 사이 건축의 유사성을 나타냅니다.
사이토케라틴(20)에 대한 항체 염색도 두 CRC 모델 모두에서 유사한 종양 성장 패턴을 보였다. 이러한 절차의 핵심은 동물을 부드럽게 치료하지만 단단히 치료하는 것입니다. 꾸준한 손으로 연습하는 것은 이러한 기술을 안전하게 수행하고 최상의 결과를 달성하는 가장 좋은 방법입니다.
일단 이 모형이 만들어지면, 암 치료의 다중 다른 양식은 환자에 있는 임상 시험의 앞에 현재 약 의 조합 및 새로 개발된 치료를 포함하여 시험될 수 있습니다. 암세포와 바늘의 취급은 그들의 안전을 위한 경험있는 인력에 의해 수행되어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다 뿐만 아니라 최적 결과를 달성하기 위하여.
