Spotiton 로봇 시스템을 사용하면 90밀리초 빠른 속도로 전자 현미경 그리드에서 상호 작용하는 파트너와 관심 있는 단백질을 혼합하고 진동시킬 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 표준 그리드 준비 기술에 의해 캡처하기에너무 일시적인 중간 단백질 확인을 캡처할 수 있습니다. 시간 해결 Spotiton은 막 채널 활성화, DNA 또는 RNA 합성과 같은 초 생물학적 또는 생화학 적 시스템을 알릴 수 있거나, 표적 단백질과 약물 또는 항체의 조기 상호 작용을 알릴 수 있습니다.
사용자는 그리드의 품질에 직접적인 영향을 미치는 여러 구성 요소를 동시에 관리해야 합니다. 그리드를 준비할 때 사용하기 전에 시스템을 이해하고 인내심을 갖는 것이 중요합니다. 먼저 질소 공급 탱크의 주 밸브를 열고 시스템 저장소가 가스가 드인 초순수물로 채워지도록 하십시오.
멀티 콘센트 전원 스트립에서 컴퓨터와 Spotiton 시스템을 켭니다. 데스크톱 아이콘을 클릭하여 Spotiton 소프트웨어의 사용자 인터페이스를 엽니다. 도구 메뉴에서 스테이지 초기화를 선택하여 3축 로봇을 초기화하고 홈으로 이동하여 디스펜서 팁이 초기화 및 호밍 전에 아래로 가리키도록 합니다.
메인 메뉴에서 안전한 위치로 이동을 클릭하여 로봇을 안전한 위치로 보냅니다. 흡인 탭에서 프라임을 선택하여 디스펜서 헤드를 저수지의 물로 여러 번 플러시합니다. 팁에서 두 개의 중단없는 물 줄기가 나타나기 전까지는 계속하십시오.
검사 탭에서 팁 하나를 검사 카메라로 보내고 화재 수를 테스트하여 이산 물방울이 생성될 때까지 진폭을 조정합니다. 상단 카메라 모니터의 레코드 버튼을 눌러 팁 1 발사 비디오를 녹화합니다. 검사 카메라에 팁 2를 보냅니다.
두 디스펜서에서 액적 생산 패턴과 일치하는 상부 카메라 모니터에서 2개의 티프가 발사되는 동시에 오른쪽 모니터에서 발사한 팁 1의 비디오를 재생합니다. 제공된 Allen 키를 사용하여 그리드 로봇의 마운트에서 핀셋을 제거합니다. 근처 벤치탑에 테스트 그리드 나노와이어 면을 그리드 블록 의 가장자리에 배치합니다.
조심스럽게 그리드의 가장자리를 잡고 핀셋에 올바르게 배치합니다. 그런 다음 핀셋을 다시 마운트합니다. Cryo 탭에서 팁 to Camera를 클릭하여 팁 하나를 상단 플런지 경로 카메라의 시야로 이동하여 상단 카메라 모니터에서 라이브를 선택하도록 합니다.
켜고 상단 카메라 조명을 조정합니다. 모니터 내의 마우스를 클릭하여 상단 카메라 모니터에 표시되는 위치 팁 1개. 카메라를 클릭하면 그리드를 카메라로 이동하여 위 카메라 앞에 그리드를 배치한 다음 필요한 경우 팁 한 위치를 다시 조정합니다.
Cryo 탭에서 바이트 그리드가 선택되지 않았는지 확인하고 큐 대상을 클릭한 다음 플런지에서 클릭합니다. 디스펜서가 정상적으로 작동하는지 확인하기 위해 상하 이미지를 평가합니다. 두 샘플을 적절한 버퍼로 원하는 농도로 희석하고, 이상적으로도 동일하게 사용하고, 냉동원 그릇을 액체 질소로 채웁니다.
플라즈마는 5와트 수소와 산소를 사용하여 3~4나노와이어 그리드를, 1.5분 간 시작점으로 청소합니다. 분무기를 연결하고 분무기 캡의 중앙 포트를 빠져나가는 증기를 관찰한다. 메인 창에서 라이브 습도 모니터를 관찰하거나 보고서 및 주변 환경에서 주변 습도 추적기를 엽니다.
챔버 및 덮개 영역의 습도 수준을 확인합니다. 샘플 컵에 각 샘플의 5 마이크로리터를 추가합니다. 샘플 컵을 왼쪽에 있는 팁 1과 오른쪽에 있는 팁 2의 샘플과 함께 홀딩 트레이에 로드합니다.
그런 다음 트레이를 좌석이 앉을 때까지 다시 기기에 밀어 넣습니다. 흡인 탭에서 각 팁에서 흡량할 볼륨에 대해 세 개의 마이크로리터를 선택합니다. 샘플 트레이가 안전하게 앉아 있는지 확인하고, 흡인을 클릭하고, 파이펫 스테이지가 디스펜서 헤드를 샘플 컵으로 이동하도록 관찰합니다.
샘플 컵을 제거하고 액체 수준에서 드롭을 관찰하여 두 샘플모두의 성공적인 포부를 확인합니다. 검사 탭에서 각 팁을 검사 카메라로 보내 방해받지 않는 디스펜싱을 확인합니다. 각 팁의 액적 형성과 일치하도록 필요에 따라 진폭을 조정합니다.
핀셋에 갓 플라즈마 청소 그리드를 로드하지만 아직 핀셋을 장착하지 않습니다. 습도 수준이 약 90~95%로 상승하여 에탄 컵을 채우고 검사 카메라 앞에서 두 팁의 최종 테스트 화재를 수행하여 방해가 없음을 확인합니다. Cryo 탭에서 팁 에서 카메라로 클릭합니다.
에탄 컵을 확인하십시오. 에탄 얼음이 형성되면 필요에 따라 에탄 가스를 추가로 녹입니다. 그리드 스테이지에 그리드가 있는 핀셋을 장착합니다.
Cryo 탭에서 그리드를 클릭하여 카메라로 이동하여 상단 카메라 모니터에 팁 이 면이 올바르게 배치되도록 합니다. 바이트 그리드, 큐 대상을 클릭한 다음 플런지합니다. 그리드 로봇을 명령하여 에탄에서 액체 질소로 그리드를 홉하고 잠긴 선반에 놓도록 명령할 때 확인을 클릭합니다.
그리드의 이미지를 검사하여 그리드를 유지하거나 버릴지 여부를 결정합니다. 그리드를 유지하면 미리 냉각된 미세 팁 집게를 가장자리로 부드럽게 잡고 노치 왼쪽의 첫 번째 슬롯부터 시계 방향으로 가는 그리드 박스 슬롯에 배치합니다. 실험 뷰어를 사용하여 보고서 및 실험을 선택하여 플런지 시의 기계 설정 및 습도 측정과 함께 상부 및 하부 카메라의 그리드 이미지를 검토하고 비교합니다.
RNA 폴리머라제를 105개의 베이스 페어DNA 올리고머에 혼합하여 단 하나의 시간 해결 스포티톤 세션 동안 제조된 그리드의 이미지가 150밀리초 전에 프로모터 서열을 운반하는 것으로 나타났다. 6개의 그리드 중 하나만 최적이 아닌 사악한 것을 보여줍니다. 유리화된 그리드의 얼음 증착 패턴은 상부 카메라 이미지에서 볼 수 있는 증착된 액체패턴과 밀접하게 일치합니다.
혼합 된 샘플의 효과적인 사악이는 나노 와이어 덮인 그리드 바를 따라 발생하며 샘플이 착륙한 것과 인접한 사각형으로 거의 오버플로되지 않습니다. 얼음으로 채워진 사각형에서 얼음은 일반적으로 사각형 중앙의 구멍 내에서 가장 두껍으며 그리드 바에 가까운 구멍에서 얇아집니다. 그리드 바에 즉시 인접한 구멍은 나노 와이어에 근접하기 때문에 종종 비어 있습니다.
나노와이어 그리드의 적절한 준비 와 처리는 혼합 샘플 그리드에 좋은 얼음 두께를 보장합니다. Spotiton 시스템은 또한 사용자가 동일한 그리드 유지 보수 세션 동안 혼합되지 않은 컨트롤의 컬렉션을 가능하게, 하나의 그리드에 별도로 두 샘플을 증착 할 수 있습니다. Spotiton은 세균성 유전자 발현에서 제1 중간제의 포획을 실시간으로 가능하게 했습니다.
그들은 하위 초 기간에 형성하기 때문에, 그들의 구조는 지금까지 알려지지 않았습니다.
