우리의 연구 팀은 극저온 전자 현미경 검사법과 극저온 전자 단층 촬영을 위한 기술 및 프로토콜을 개발합니다. 우리는 극저온-ET 실험을 위한 세포 성장 및 포지셔닝을 지시하기 위해 TEM 그리드를 마이크로패터닝하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 전세포 극저온 전자 단층 촬영은 네이티브 냉동 수화 상태로 보존된 세포 내의 거대 분자 복합체의 나노미터 수준의 해상도 구조를 생성하는 데 사용됩니다.
마이크로패턴화는 전세포 냉동고-ET, 저온-상반신 광 전자 현미경 검사법 및 저온 중심이온 빔 밀링 실험의 처리량을 증가시킬 수 있다. EM 그리드에 있는 세포의 수 그리고 분포는 전세포 cryo-ET 연구 결과에 중요합니다. 이 프로토콜은 마이크로패터닝을 통해 EM 그리드에서 세포 성장을 유도하는 신속하고 재현 가능한 광범위하게 적응가능한 방법을 제공합니다.
조사관은 파이펫, 핀셋, 기본 세포 배양 기술, 형광 및 전송 전자 현미경을 사용하여 편안해야합니다. 처음으로 패킹시, 잘 알려진 세포 유형과 ECM 조합을 사용하여 커버립 이나 MatTek 접시에 그들을 테스트. 이 프로토콜 개발에 관여하는 연구 팀 구성원은 다음과 같습니다.
브라이언 시버트, 조셉 김, 양 박사. 먼저 그리드 를 그리드 준비 홀더로 옮기고 광채를 배출하여 그리드 탄소 측을 위로 위로 전달합니다. 다음으로, 탄소 면으로 그리드를 깨끗한 유리 슬라이드 또는 커버슬립까지 전송하여 그리드 간에 적어도 1센티미터 분리합니다.
파이펫 10 마이크로리터 0.05 폴리-L-리신을 각 그리드에 올리고 적어도 30분 동안 습한 챔버에서 그리드를 배양한다. 인큐베이션 후 pH 8.5에서 0.1 개의 어금니 HEPES의 15 마이크로 리터로 각 그리드를 세 번 세척하십시오. 각 세척에서 그리드를 30초 동안 배양한 다음 그리드를 건조시키지 않고 파이펫으로 대부분의 액체를 그리드에서 제거합니다.
마지막 세척 후 각 그리드를 0.1 개의 어금니 HEPES의 15 마이크로 리터에 둡니다. 다음으로 PEG-SVA 솔루션을 준비하고 그리드의 HEPES 솔루션을 PEG-SVA 용액의 10 마이크로리터로 즉시 교체한 다음 습한 챔버에서 그리드를 1시간 이상 배양합니다. 인큐베이션 후, 각 그리드를 멸균수 15마이크로리터로 세 번 세척하여 각 세척시 그리드를 30초 동안 배양합니다.
마지막 세척 후, 물 15 마이크로 리터에 각 그리드를 둡니다. 새로운 클린 커버슬립의 중앙에 마이크로리터 한 방울의 물을 한 방울 만드신 다음, 15마이크로리터 물 방울에서 탄소 면을 위로 한 새로운 커버슬립의 드롭으로 조심스럽게 그리드를 옮기습니다. 다음으로, 그리드를 중심으로 유지하고 그리드의 탄소 호일과 스텐실 접촉을 최소화하는 그리드 위에 PDMS 스텐실에 신중하게 배치합니다.
그런 다음 PLPP 젤 1마이크로리터를 그리드에 넣고 파이펫을 부드럽게 섞습니다. 그리드가 있는 커버슬립을 어두운 위치로 이동하여 건조시다. 젤은 15-30 분 안에 건조합니다.
마이크로 패터닝을 위해 현미경에서 라이브 브라이트 필드 보기로 소프트웨어를 엽니 다. 초기 실행에 대한 새 템플릿을 디자인하려면 ROI 추가를 선택하고 3, 000 마이크로미터 원을 선택합니다. 화면의 브라이트필드 이미지를 사용하여 그리드 위에 원 ROI를 배치한 다음 잠금을 눌러 ROI를 고정합니다.
ROI를 제자리에 고정한 후 패턴 추가를 선택하고 적절한 패턴을 선택합니다. 복제 옵션을 사용하여 초기 패턴의 복사본을 생성하여 8개당 8개의 그리드 정사각형 영역을 만듭니다. 패턴을 그리드 사각형과 정렬하려면 필요에 따라 간격과 각도를 조정합니다.
패턴을 그리드의 한 구석에 배치합니다. 다음으로, 패턴을 복제하고 각 영역에 필요한 현미경 단계를 이동하는 그리드의 네 모서리 각각에 사본을 배치합니다. 복제 옵션을 사용하여 8/8 그리드 사각형 영역을 중앙 양쪽에 배치할 8개 그리드 사각형 영역을 2~8개의 그리드 사각형 영역으로 수정합니다.
중앙 4개의 그리드 사각형을 패턴이 없는 상태로 둡니다. 각 패턴에 대해 필요한 경우 총 용량을 조정합니다. 평방 밀리미터당 30 밀리줄은 좋은 출발점입니다.
전문가 옵션에서 패턴의 각도, 위치, 공간 및 비율을 조정하여 패턴의 정렬을 그리드 사각형과 조정합니다. 현미경 스테이지를 이동하여 브라이트필드 디스플레이의 그리드 영역을 변경합니다. 템플릿과 패턴이 배치되면 소프트웨어의 작업 패널의 영역 중 하나를 제외한 모든 영역을 선택 취소합니다.
현미경 단계를 사용하여 해당 영역으로 이동하여 탄소 호일에 집중하십시오. 액션 패널의 안구 아이콘을 클릭하여 패턴 오버레이 디스플레이를 전환합니다. 그리드가 집중되면 브라이트필드 셔터를 닫고 소프트웨어 오른쪽 하단에 있는 Play 아이콘을 눌러 실시간으로 모니터링할 수 있는 패터닝 프로세스를 시작합니다.
모든 영역이 패턴화될 때까지 이 단계를 반복합니다. 마지막으로, 현미경에서 그리드로 커버슬립을 제거하고 즉시 10 마이크로리터의 멸균 PBS를 그리드에 추가합니다. 10분 후 핀셋으로 스텐실을 제거한 다음, 15마이크로리터의 PBS로 그리드를 세 번 세척하고 각 그리드를 PBS에 어두운 위치에 둡니다.
각 그리드에 대해 세포외 매트릭스의 15 마이크로리터를 준비한 다음 각 그리드에서 PBS를 세포외 매트릭스의 15 마이크로리터로 교체하고 습한 챔버에서 그리드를 적어도 한 시간 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 이전에 설명한 것처럼 멸균 PBS 의 15 마이크로리터로 각 그리드를 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, PBS에 각 그리드를 둡니다.
형광 현미경을 사용하여, 패터닝을 확인하기 위해 세포 외 매트릭스의 형광을 감지하고 탄소 호일은 그대로 유지된다. 마이크로패턴 및 무패턴 TEM 그리드에 시드된 HeLa 세포는 칼세인 AM및 에티듐 호모머-1 기반 세포 생존가능성 분석기를 사용하여 형광 염색에 의해 볼 수 있다. 혼합 콜라겐과 피브리노겐 세포 외 매트릭스를 사용하여 HeLa 세포는 그리드 전체의 패턴을 쉽게 준수합니다.
패턴을 따라 확장 된 세포의 전반적인 형태는 패턴되지 않은 그리드에서 자란 세포의 형태와 유사합니다. RSV 감염 BEAS-2B 세포의 브라이트 필드 이미지는 18 시간 포스트 시드 패턴의 중앙 영역을 따라 세포 접착 및 성장을 보여줍니다. 감염된 세포의 대부분은 그라데이션 패턴의 고밀도 중앙 영역을 따라 배치된다.
RSV 변이체는 마이크로패턴 그리드에서 자란 감염된 BEAS-2B 세포의 주변에 가깝게 위치한다. 많은 RSV 구조 단백질은 뉴클레오캡시드 및 바이러스 융합 단백질을 포함하는 토모그램 내에서 확인된다. 마이크로패턴 그리드에서 범신경 GFP 발현을 사용하는 드로소필라 뉴런은 형광 라벨링과 마이크로패턴 내에 있는 위치로 인해 가벼운 현미경 검사법에 의해 쉽게 추적할 수 있습니다.
패턴되지 않은 그리드의 뉴런은 또한 빛 현미경 검사법에 의한 GFP 신호를 통해 추적될 수 있습니다. 그러나, 극저온 전자 현미경 검사법에서 찾아내는 것은 세포 파편 및 매체에서 오염 때문에 어려워집니다. 뉴런 세포 체체및 확장된 중성염의 치수로 인해, 저온 전자 단층 촬영 기울기 계열은 더 높은 배율로 세포의 얇은 영역을 따라 수집됩니다.
신경 세포 막, 미토콘드리아, 마이크로투룰, 액틴 필라멘트, 혈관 구조 및 리보솜과 같은 거대 분자는 3D 토모그램을 통해 더 높은 배율 이미지 몽타주와 슬라이스에서 잘 해결된다. 유사한 세포 외 특징은 패턴되지 않은 뉴런의 3D 토모그램에서 관찰됩니다. 그리드에 스텐실을 적용하고 PLPP 젤에 추가하는 것은 패터닝 결과에 영향을 미칠 수 있고 주의해서 수행해야 하는 가장 민감한 단계입니다.
Cryo-CLEM은 cryo-ET 데이터 수집을 위해 셀 내에서 관심 있는 대상을 현지화하는 데 사용할 수 있습니다. Cryo-FIB-SEM은 데이터 수집을 위해 너무 두꺼운 영역에서 얇은 셀에 사용할 수 있습니다.
