장기 저장 후 난소 세포의 잠재적 생존의 유지는 좋은 기회의 도구를 나타냅니다. 청소년 난수체 진동은 번식 프로그램의 생성 간격에서 훨씬 짧아졌습니다. 초고속 냉각 및 온난화에 의한 진동은 가축 난소 보존의 표준 접근법으로 간주됩니다.
그러나 양에서이 절차는 여전히 비교적 새로운 것으로 간주되며 표준 방법이 부족합니다. 이 비디오에서는 청소년과 성인 기증자 모두에서 수집한 양 난미세포의 병용 과실을 위한 프로토콜을 설명하고, 냉동 보존 이전에 숙성된 체외에서 설명합니다. 이 프로토콜에는 체외 성숙, 시험 신분, 온난화 및 온난화 후 문화의 모든 절차가 포함됩니다.
정전기에서 24시간 동안 시험관에서 숙성된 Cumulus 난모세포 복합체를 회수한 후, 성숙 배지에서 트레할로오스의 백 마이크로몰러를 보충하는 조건. 체외 성숙에 따라, 난모세포는 60배 배율로 스테레오 현미경으로 부드럽게 피펫팅하여 기계적으로 적수푸스 세포를 탈피하였다. 바이트화 절차에서 제출할 난모세포의 선택은 이 절차의 성공적인 적용을 보증하는 첫 번째 중요한 단계를 나타냅니다.
지질 방울의 균일한 분포, 모든 엠마의 무결성및 공간에서 연속적인 중추적인, 약 19 마이크로미터의 외경을 작고, 첫 번째 극지 체의 압출을 나타내고, 따라서 M2에서, 스테이지를 선택해야 한다. 유리화는 극저온 장치와 함께 최소 필수 볼륨 방법을 사용하여 수행되었다. 선발 후, 5명의 청소년 난모세포그룹이 2분 동안 기본 배지에서 섭씨 38.5도로 조절되었습니다.
난모세포는 교정 용액에 3분 동안 노출되어 탈수되었습니다. 사용되는 유리화 장치에 난모세포의 하중은 중요하고 중요한 단계입니다. 극저온은 홀더에 부착된 폴리프로필렌 스트립을 사용합니다.
이 방법에서, 진동용액의 난모세포는 0점 미만의 밀리리터가 필름 스트립 위에 유리 모세관으로 빠르게 적재된다. 그런 다음 용액을 제거해야 하며, 극저온 보존될 세포를 덮을 수 있을 만큼 얇은 층을 남겨두어야 합니다. Cryotop 장치에 로드되기 전에 30 초 이내에 액체 질소로 직접 급락했습니다.
따뜻한 실내 생물학적 온도를 위해, 각 유리화 장치의 함량은 액체 질소에서 200 마이크로리터 방울로 리할로오스 용액을 감소시키는 것으로 옮겨졌다. 난피테는 얇은 유리 파이펫으로 난모세포를 드래그하여 추적 형 냉동 보호제의 제거를 촉진하기 위해 세트를 이송했다. 마지막으로, 난모세포는 5%의 이산화탄소를 배양한 배양기의 기본 배지에서 미리 번식하였다.
온난화 직후, 그리고 온난화 후 문화의 각 시간 지점에 대해, 난소세포는 100배 배율로 반전된 현미경을 사용하여 형태학적으로 평가되었다. 청소년 기증자의 난모세포의 극저온 허용 오차는 온난화 후 멤브레인 무결성이 낮은 변경된 것과 비교하여 낮습니다. 청소년 난소에서 유도 된 성숙 배지에서 트레할로스의 사용은 더 높은 막 무결성을 증가시켜 진동 후 생존율을 증가시킵니다.
그러나 골짜기, 수정, 및 청소년 난모세포의 발달 속도는 trehalose 보충에 의해 증가되지 않았다. 칼슘 농도가 2.2 밀리그램에 해당하는 탄압을 가진 매체를 사용하여 청소년 난모세포의 진동을 위해, 칼슘 농도로 진동하는 난모세포에 비해 더 높은 수정률을 취해야 하지만, 생산을 가능하게 하는 차이는 발견되지 않았다. 서로 다른 기간에 대한 온난화 후 문화를 비교하여, 우리는 이전 두에서 수집 된 배양 난미세포의 4 시간 후 에너지 결합및 미세 관 설정을 복구 할 수 있음을 보여 주었다, 높은 분열과 blastocytes 폐기물로 개발 능력을 복원 할 수 있습니다.
미토콘드리아 활동은 다른 시간 점에 비해 온난화 후 문화의 4 시간 후에 유리화 된 따뜻한 청소년 난모세포에서 더 높았다. 미토콘드리아 분포 이별또한 온난화 후 6시간 동안 변경되었습니다. 더욱이, 반응성 산소 종 세포 내 수준은 0, 4, 및 6 시간에 비해 온난화 후 문화의 2 시간에 청소년 난모세포에서 현저하게 낮았다.
그러나, 그리고 다른 난모세포에서 찾아낸 것과 는 대조적으로, 자발적인 parthenogentic 활성화의 비율은 청소년 난모세포에 있는 포스트 온난화 문화 도중 증가했습니다. 제안 된 방법의 주요 장점 중 하나는 난소 수집에서 체외 성숙, 진동 및 온난화에 이르기까지 모든 단계를 포함한다는 것입니다. 또한 온난 후 문화 기간을 포함하여 진동 절차 중에 발생한 손해로부터 난토테 복구를 허용합니다.
수정을위한 최적의 시간을 선택하는 것은 도전이며, 유리화 프로그램의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 느린 동결과 는 달리, 유리화가 수동 기술이며, 따라서 연산자 의존적이라고 생각되어야합니다. 이러한 이유로, 주요 과제는 시험화 프로그램의 결과 평가에서 운영자 효과를 고려하는 숙련 된 기술자와 연구원의 필요성입니다.
우리의 실험실에서 추가 연구는 oocyte 진동 절차 및 선택을 표준화하는 시도, 청소년 oocyte의 요구에 미디어 구성을 더 잘 조정할 수 있습니다. 문화와 성격과 항산화제의 사용에 대한 무시는 유망한 기회를 제공합니다.
