이 예산 친화적 인 자기 비드 기반 DNA 추출 프로토콜은 자원 제한된 실험실 및 연구에 액세스 할 수있는 높은 처리량 시퀀싱을 합니다. 이 프로토콜은 고품질 DNA 추출을 위한 고가의 장비를 필요로 하지 않으며 높은 처리량 시퀀싱을 위한 질로 충분한 양의 DNA를 얻는 것이 어려운 특정 진단 또는 연구 상황에서 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 일회성 데모로 쉽게 복제할 수 있습니다.
워크플로에 익숙해지려면 먼저 소수의 샘플로 시도해야 합니다. 우선, PCR 급수 의 100 마이크로리터를 추가하고 조직을 부드럽게하기 위해 섭씨 4도에서 1 시간 동안 배양하여 70 % 이상의 알코올에 저장된 모기 조직 샘플을 수화하십시오. 인큐베이션 후 물을 버리고 100 마이크로리터의 Proteinase K 완충 효소 믹스를 추가합니다.
그런 다음 마이크로 원심 분리기 튜브유봉을 사용하여 조직을 균질화하십시오. 균질화 후, 원심분리하고 56섭씨에서 2~3시간 동안 조직을 용해시키고 배양한다. DNA를 추출하기 위해 조직의 파이펫 100 마이크로리터가 새로운 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 분해됩니다.
그런 다음 마그네틱 비드 마스터 믹스의 215 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫을 사용하여 용액과 마그네틱 구슬 혼합물을 10~20초 동안 섞은 다음 실온에서 10분 동안 방치합니다. 잠복하는 동안, 부드럽게 자기 구슬에 DNA의 결합을 극대화하기 위해 때때로 튜브를 흔들어.
다음으로, 용액이 명확해질 때까지 자기 비드 분리기 위에 튜브를 놓습니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 DNA를 들고 있는 자기 구슬을 방해하지 않고 튜브에서 액체를 부드럽게 흡인시합니다. 마그네틱 비드 분리기에서 튜브를 멀리 이동하고 세척 버퍼 1의 325 마이크로 리터를 추가하여 구슬을 씻어.
피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분간 배양합니다. 인큐베이션 후, 튜브를 마그네틱 비드 분리기 위에 놓고 이전에 설명한 대로 상체를 제거한 다음, 자기 비드 분리기에서 튜브를 멀리 이동시키고 완충액으로 한 번 구슬을 세척합니다. 완충1로 두 번째 세척 후, 250 마이크로리터의 세탁 버퍼 2개로 구슬을 두 번 씻는다.
마지막 세척 후, 자기 비드 분리기에서 멀리 튜브를 이동하고 용출 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫팅으로 철저히 섞은 다음 실온에서 2분 동안 튜브를 배양한 다음 마그네틱 분리기위에 다시 놓습니다. 용액이 명확해지면 상체를 새롭고 깨끗한 0.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮기고 적절하게 보관하십시오.
0.5 밀리몰러 EDTA를 함유하는 용출 완충제에서 모기 DNA의 전형적인 마이크로볼륨 형광계 판독으로 여기에 도시되었다. 평균 260 ~ 280 나노미터 흡광도 비는 2.3이다. 이 표는 다른 추출 방법에 대해 하루 동안 처리된 샘플의 비용과 수를 보여 주어 있습니다.
이 프로토콜에 의한 추출에 대한 일반적인 시약 및 소모품 비용은 샘플당 약 9.50입니다. 이 비용은 일반적인 자기 비드 기반 추출 방법과 동일합니다. 이 프로토콜의 주요 비용 이점은 자동화 된 DNA 추출 기기를 필요로하지 에서 비롯됩니다.
여러 샘플로 작업할 때 DNA의 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 간에 파이펫 팁을 변경해야 합니다. 우리는 전체 게놈 시퀀싱을 위해이 방법을 사용하여 추출 된 고품질의 DNA를 사용합니다. 우리는 현재 공중 보건 및 질병 통제에 있는 우려의 살충제 저항 또는 면역 유전자에 있는 새로운 돌연변이를 확인하기 위하여 시퀀싱 데이터를 사용하고 있습니다.
높은 처리량 시퀀싱을 위한 적당한 해결책을 갖는 것은 많은 새로운 유전 통제 전략의 성공에 영향을 미치는 모기 분산및 유전자 흐름을 이해하기 위한 인구 유전체학 및 조경 유전체학을 위한 흥미진진한 문을 엽니다.
