이 프로토콜은 다양한 세포 과정을 이해하는 데 필수적인 단백질 형성 역학의 검출 및 특성화에 사용할 수 있습니다. 다른 방법에 비해, 이 방법은 특수 한 샘플 준비 단계를 필요로 하지 않으며 운동, 열역학 및 확인 평형의 구조적 측면의 포괄적인 특성화를 제공합니다. CPMG 이완 분산은 핵산 및 기타 생체 분자의 확인 역학의 특성화뿐만 아니라 리간드 나노 입자 상호 작용의 특성화를 위해 더 널리 적용될 수 있다.
우리의 프로토콜은 처음 CPMG 사용자를 대상으로합니다. 그래서 좋은 출발점입니다. 그러나 사용자는 기존의 NMR 실험을 실행하기 위한 기본 단계를 알고 있기를 기대합니다.
NMR 실험을 처음으로 설정하려면 먼저 이러한 보충 파일을 다운로드하고 압축 해제합니다. 비트를 복사합니다. vv 와 trosy_15N_CPMG.
펄스 프로그램 폴더의 vv 파일이 펄스 프로그램 디렉토리에 연결됩니다. 획득 소프트웨어를 열고 EDC 명령을 사용하여 이전에 실행된 수소 질소 15 HSQC 실험을 새로운 실험으로 복사합니다. 펄스 프로그램 명령을 사용하여 trosy_15N_CPMG 로드합니다.
vv 펄스 프로그램 파일을 새로 만든 실험에 넣습니다. 그런 다음 펄스 프로그램 파일의 끝에서 지침을 사용하여 CPMG 실험을 설정합니다. 일상적인 NMR 실험을 설정하려면 샘플을 자석에 소개하고 모든 기본 NMR 획득 단계를 수행합니다.
지속 기간 질소 15 하드 90도 펄스에 수소 하드 90도 펄스 및 P7의 지속 시간으로 P1을 설정합니다. 획득 창에서 수소 및 질소 15 치수에 대한 중심 및 스펙트럼 폭을 설정합니다. 이완 지연을 0.7 T2로 설정하고 VC 목록 명령을 사용하여 N.에 해당하는 정수 번호 목록을 만든 후 목록의 각 항목이 D30으로 나눈 CPMG에 따라 다른 CPMG 필드에 해당하는지 확인한 후 목록의 첫 번째 번호가 0이 아닌지 확인합니다.
L8을 VC 목록의 항목 수로 설정하고, L3을 간접 차원의 실제 포인트 수로, 1TD에서 L8배 L3배 2회로 설정합니다. 물 억제를 최적화하려면 수신기 게인을 하나로 설정하고 EDC 끌어오기를 입력하여 펄스 프로그램 파일을 엽니다. 91번 줄에서 goto 999 앞에 있는 세미 콜론을 제거하고 파일을 저장합니다.
GS 명령을 사용하여 SPDB0 매개변수를 조정하여 FID 신호의 강도를 최소화합니다. 신호 강도가 수정되면 펄스 프로그램 파일의 91줄에서 세미 콜론을 다시 도입하고 파일을 저장합니다. SPDB11을 최적화하려면 수신기 게인을 하나로 설정하고 EDC 유형은 펄스 프로그램 파일을 엽니다.
168호선에서는 goto 999 앞에 있는 반결을 제거하고 파일을 저장합니다. GS 명령을 사용하여 SPDB11 매개 변수를 조정하여 FID 신호의 강도를 최소화합니다. 신호 강도가 수정되면 168줄에서 반결을 다시 도입하고 파일을 저장합니다.
SPDB2를 최적화하려면 수신기 게인을 하나로 설정하고 EDC 끌어오기를 입력하여 펄스 프로그램 파일을 엽니다. 179호선에서는 goto 999 앞에 있는 반결을 제거하고 파일을 저장합니다. GS 명령을 사용하여 SPDB2 매개변수를 조정하여 FID 신호의 강도를 최소화합니다.
신호 강도가 수정되면 펄스 프로그램 파일의 179줄에서 세미 콜론을 다시 소개하고 파일을 저장합니다. PLDB2를 최적화하려면 수신기 게인을 하나로 설정하고 EDC 끌어서 펄스 프로그램 파일을 엽니다. 184호선에서는 goto 999 앞에 있는 반결을 제거하고 파일을 저장합니다.
GS 명령을 사용하여 PLDB2 매개 변수를 조정하여 FID 신호의 강도를 최소화합니다. 신호 강도가 수정되면 펄스 프로그램 파일의 184줄에서 세미 콜론을 다시 도입하고 파일을 저장합니다. RGA 명령을 실행하여 수신기 게인을 최적화합니다.
그런 다음 ZG 명령을 실행하여 실험을 시작합니다. 이 그림에서, 수소 질소(15 Trosy 스펙트럼)에서 각 피크에 대해 획득된 이완 분산 프로파일의 결과를 관찰할 수 있다. 획득된 이완 분산 프로파일에서 각 중추 AMI 그룹의 질소 15 횡방향 이완에 대한 교환 기여도를 추정할 수 있다.
조사 중인 단백질의 3D 구조에 대한 횡방향 이완을 플로팅함으로써 마이크로초 밀리초 시간 척도에서 확인 교환을 받는 구조 영역을 식별할 수 있다. 카버-리차드 방정식을 사용하여 이완 분산 곡선을 모델링하면 평형에서 국가의 분수 인구 및 이들 주 간의 교환 속도와 같은 교환 프로세스의 열역학 및 운동 파라미터를 반환합니다. 이러한 열역학 및 운동 파라미터의 온도 의존성은 각각 van't Hoff 및 I-링 방정식을 사용하여 모델링하여 확인 교환의 에너지에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다.
모든 인수 파라미터, 특히 P7을 신중하게 최적화하는 것이 중요합니다. 또한 스퓨리어스 분산을 피하기 위해 매우 순수하고 균일한 샘플을 생산하는 것도 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 운동, 열역학 및 화학 칩 파라미터는 확인 교환을 겪고 있는 종에 대한 에너지 및 구조적 정보를 도출하는 데 사용될 수 있다. CPMG 방법에 의해 얻어진 단백질 확인 역학의 특성화는 시그널링 및 효소 활성을 이해하는 데 중요한 정보뿐만 아니라 약물 설계에 대한 새로운 관점을 제공합니다.
