안녕하세요,이 비디오에서 우리는 바이러스 성 감염에 m6A와 m5C 에픽스테마테스를 탐구하는 방법을 보여줍니다. 실험을 시작하려면 감염되지 않은 상태에 대해 5천만 개의 세포와 감염된 상태를 위해 5천만 개의 세포가 필요합니다. 분석 시 고품질 데이터 집합을 얻으려면 범용 감염을 달성해야 합니다.
여기서 우리는 HIV 기지를 둔 벡터로 이 세포를 감염시키고 FACS에 의해 바이러스성으로 인코딩된 GFP를 측정합니다. 이 경우, 감염된 세포의 80%를 가지고 있었고 총 RNA 추출부터 워크플로우를 진행했습니다. 그래서 우리는 각각 1,000만 개의 알리쿼트에 세포를 나누고 트리졸의 1mL에 감아 놓았습니다.
그런 다음 200 마이크로리터의 클로로폼을 세포 리세이트에 추가하고 반전으로 혼합했습니다. 이 시점에서, 우리는 lysate실온에서 3 분 동안 앉아 다음 원심 분리 모든 샘플을 4도에서 15 분 동안 고속으로 합니다. 여기에 표시된 것처럼 세 가지 단계에서 위상 분리가 있을 것으로 예상됩니다.
RNA는 상층에 앉기 때문에 유기층을 옮기지 않도록 주의를 기울여 수성상을 신선한 튜브로 조심스럽게 전달한다. 이 시점에서, 수성 상에 이소프로판올의 0.5 mL을 추가하고 반전에 의해 신중하게 혼합. 샘플은 RNA 강수량을 보장하기 위해 80도에서 1 시간 배양 될 수 있습니다.
고속으로 원심분리시, 여기에 표시된 바와 같이 좋은 RNA 펠릿을 볼 수 있어야 합니다. 조심스럽게 반전이나 파이프팅에 의해 상체를 폐기, 펠릿을 방해하지에주의를 지불. 그런 다음 RNA 펠릿을 75%의 분자 등급 에탄올1mL로 세척합니다.
그리고 샘플을 간략하게 소용돌이. 원심 분리시, 좋은 흰색 RNA 펠릿을 검색해야 합니다. 상체를 버리고 RNA 펠릿이 실온에서 15 분 동안 건조하게하십시오.
물과 함께 동일한 조건에서 모든 샘플을 풀 의 20 마이크로 리터에서 각 펠릿을 다시 중단합니다. 총 RNA는 이제 폴리-A 선택에 의한 mRNA 절연을 위한 준비가 되어 있습니다. RNA 75 마이크로그램의 각 샘플에 대해, 올리고-DT 자기 구슬의 200 마이크로리터를 준비하고 결합 완충제의 1mL에서 세척하십시오.
튜브를 자기 스탠드에 놓고 구슬이 한 믹스 중에 자석에 결합되도록 합니다. 상체를 버리고 두 번째 세척 절차를 반복하십시오. 그런 다음 자기 스탠드에서 구슬을 제거하고 100 마이크로리터의 결합 버퍼로 조심스럽게 다시 중단합니다.
이 시점에서, 100 마이크로리터의 물에서 재중단된 알리쿼트 당 RNA의 75 마이크로그램으로 나누어 RNA 샘플을 준비한다. 결합 버퍼 100 마이크로리터를 추가하고 65도에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 회전하고 얼음에 배양합니다.
그런 다음 각 RNA 샘플에 세척 된 자기 구슬 100 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 15 분 동안 회전 바퀴에 바인딩을 허용합니다. 인큐베이션 시 튜브를 다시 마그네틱 랙에 넣고 1분 동안 배양하게 하십시오. 그런 다음 상체를 신선한 튜브로 복구하고 두 번째 격리를 위해 옆으로 유지하십시오.
200 마이크로리터의 세척 완충제로 구슬을 두 번 씻은 다음 용출을 진행합니다. 마그네틱 비드에서 폴리-A선택 RNA를 elute하기 위해 각 시료와 파이펫에 20 마이크로리터의 얼음 냉은 TRIS HCl을 신중하게 추가합니다. 그런 다음 2 분 동안 80도에서 샘플을 배양하여 구슬에서 RNA를 방출하십시오.
폴리-A선택 RNA를 함유한 상체를 신선한 튜브로 옮기고, 비드 이월을 피하는 데 주의한다. 용출 단계뿐만 아니라 절연 단계는 mRNA 수율을 높이기 위해 두 번 반복되어야한다. mRNA는 이제 단편화 단계에서 meRIP-Seq 파이프라인에 진입하거나 비설피트 변환으로 직접 전환할 준비가 되었습니다.
meRIP-Seq 파이프라인을 입력하는 첫 번째 단계는 mRNA 단편화로 구성됩니다. 이를 위해 0.2 mL 튜브에서 18 마이크로 리터의 알리쿼트로 나누어 진 5 마이크로 그램의 mRNA가 필요합니다. 일관된 데이터를 보장하기 위해서는 당시 샘플이 거의 없는 신속하게 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.
이 실험을 위해, 단편화는 115와 200 뉴클레오티드 사이의 크기의 단편을 얻기 위하여 최적화되었습니다. 그런 다음 각 튜브에 18 마이크로리터를 함유한 단편화 시약 2개를 튜브 벽에 증착하는 데 주의하십시오. 시약과 RNA 사이의 접촉을 동시에 허용하고 15 분 동안 70도에서 배양하기 위해 모든 샘플을 스핀 다운합니다.
잠복기가 끝나면 0.5 M EDTA의 두 개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중지하십시오. 이 시점에서, 당신은 선택의 방법으로 단편화 된 mRNA를 정화하고 단편 분석기에 의해 RNA 품질 관리를 진행할 수 있습니다. 이 단계는 선택 사항이지만 RNA 강수량을 참여시키기 전에 조각의 크기를 평가할 수 있습니다.
네 번째 차선에서 볼 수 있듯이, 우리는 각각 약 150 뉴클레오티드의 샘플 단편을 모두 얻습니다. 그런 다음 메립-세크를 진행했습니다. 첫 번째 단계는 항m6A 항체 또는 IgG 컨트롤을 가진 커플 A/G 자기 구슬로 구성됩니다.
각 반응 계획에 대해, 신선한 튜브로 자기 구슬의 25 마이크로 리터를 전송합니다. 최소 한 개의 m6A 전용 상태와 하나의 제어 조건이 필요합니다. 250 마이크로리터의 IP 버퍼로 구슬 25마이크로리터를 세척합니다.
구슬을 위아래로 파이프로 부드럽게 재차질하고 튜브를 자기 랙에 1분 동안 놓아 비드 분리를 허용합니다. 자석 구슬을 흡입하지 않고 한 번 세척 단계를 반복하여 주의를 기울이십시오. 그런 다음 구슬의 원래 부피의 각각 25 마이크로 리터 당 IP 버퍼의 100 마이크로 리터에서 자기 구슬을 다시 일시 중지합니다.
각 조건당 하나의 튜브를 준비하고 라벨을 부착합니다. 우리의 경우, 우리는 감염된 상태에 대한 두 개의 튜브, m6A에 대한 하나, IgG 제어를위한 하나, 감염되지 않은 상태에 대한 두 개의 튜브를 해야합니다. 그런 다음 각 튜브에 세척 된 구슬 100 마이크로 리터를 추가합니다.
구슬은 이제 특정 항체 또는 IgG 제어와 결합될 준비가 되어 있습니다. 세척된 자기 구슬 100 마이크로리터를 포함하는 각 튜브에 특정 항m6A 항체 또는 안티 IgG 대조군 항체의 5마이크로그램을 추가합니다. 회전 휠에서 튜브를 30분 배양하여 항체 비드 의 연상을 허용합니다.
한편, 샘플 준비를 진행한다. 각 계획된 조건에 대해, m6A 특이적 또는 IgG 제어, 당신의 시작 재료는 100 마이크로 리터의 물 재중단 단편화된 mRNA의 2.5 마이크로그램이 될 것입니다. 500 마이크로리터의 최종 반응 부피를 갖도록 각 샘플에 295 마이크로리터의 물을 추가하십시오.
그런 다음 샘플 당 총 200 단위의 양에 대한 마이크로 리터 당 40 단위에 농축 RNAase 억제제의 다섯 마이크로 리터를 추가하고 부드럽게 혼합. 마지막으로 각 튜브에 5X 농축 IP 버퍼100 마이크로리터를 추가합니다. 견본은 지금 면역 강수반응에 대한 준비가 되었습니다.
회전 휠에서 항체와 결합 된 자기 구슬을 검색하고 아래로 회전합니다. 특정 항체와 결합된 구슬의 각 100 마이크로리터에 이전에 준비된 샘플의 500 마이크로리터를 추가합니다. 구슬을 완전히 재페수 리펜션하기 위해 여러 번 위아래로 파이프를 사용하여 부드럽게 섞습니다.
2시간 동안 회전 휠에 해당 또는 meRIP 반응을 4도인 배양합니다. 잠복기가 끝나면 각 튜브를 회전시키고 1분 동안 자기 랙에 놓아 비드 분리를 허용합니다. 그런 다음 언바운드 분획을 제거하고 신선한 튜브에 놓고 필요한 경우 추가 분석을 위해 보관하십시오.
랙에서 자석을 제거하고 IP 버퍼의 500 마이크로 리터로 모든 샘플을 다시 일시 중지합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 각 샘플을 신중하게 다시 중단합니다. 랙에 자석을 삽입하고 1분 동안 배양한 다음 상체를 조심스럽게 제거합니다.
세척을 두 번 반복한 다음 용해로 진행합니다. 샘플의 각 몇 대 한, m6A 특정 및 제어, 정제 된 m6A의 20 밀리머를 포함 하는 용출 버퍼의 225 마이크로 리터를 준비. 그런 다음 샘플당 용출 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다.
로커의 4도에서 모든 샘플을 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 모든 m6A 농축 RNA 샘플을 신선한 튜브에 수집하고 두 번째 용출을 진행한다. 선택의 방법으로 m6A 농축 RNA를 정화하고이 시점에서 샘플은 라이브러리 준비 및 시퀀싱을위한 준비가되어 있습니다.
m5C 수정을 조사하기 위해 비설피트 변환을 사용합니다. 폴리 아데니어RNA 500 나노그램으로 실험을 시작합니다. 선택 사항이지만, 리보소말 표현을 보장하기 위해 다A 고갈 된 RNA의 샘플 500 피코그램과 시퀀싱 시동 시 비황산염 전환율을 평가할 수 있습니다.
시료를 20마이크로리터의 최종 부피로 조정한 다음 각 샘플에 RNA 변환 시약 130마이크로리터를 추가합니다. 위아래로 파이프를 사용하여 조심스럽게 섞어서 모든 샘플을 회전시켜 튜브 측면에 물방울이 남아 있지 않은지 확인합니다. PCR 기계에 모든 샘플을 5분 동안 70도, 45분 동안 54도에서 비황피트 변환을 3사이클동안 배양합니다.
빈 컬럼, RNA 결합 버퍼 250 마이크로리터, 비설피테 변환 시료의 150 마이크로리터에 직접 추가하여 열 내 분해를 수행합니다. 시료를 위아래로 피펫팅하여 혼합하지만 컬럼 필터를 건드리지 않음으로써 주의를 기울입니다. 샘플 RNA 결합 완충 혼합물에 95-100%에탄올의 400 마이크로리터를 컬럼에 직접 첨가한다.
캡을 닫고 반전으로 즉시 섞습니다. 샘플을 30초 동안 회전하고 흐름을 폐기합니다. 세탁 버퍼로 컬럼을 씻은 다음 각 열의 중앙에 200 마이크로리터의 황량 솔루션을 추가합니다.
모든 샘플을 실온에서 30분 동안 배양하십시오. 30초 동안 샘플을 회전한 다음 두 번의 세척을 진행합니다. 각 시료에 400 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고, 원심분리기는 최대 속도로 30초 동안 추가하고 흐름을 폐기합니다.
컬럼을 새로운 빈 튜브에 넣고 비설피테 변환된 RNA를 20 마이크로리터의 물로 엘로트합니다. RT-qPCR에 의한 비설피테 변환 효율을 제어한 다음 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 진행합니다. 생체 정보 분석 시 이 워크플로우를 통해 얻을 수 있는 몇 가지 결과의 예가 있습니다.
여기서 우리는 HIV 감염 된 세포의 epitranscriptome 대 비 감염 된 세포를 비교합니다. 24 시간 감염 후. A 패널에서 m6A 에피레마메를 탐색하는 결과를 볼 수 있습니다.
이 그래프에서는 meRIP-Seq 분석에 m6A가 농축된 판독을 플롯합니다. 우리는 아연 손가락이 감염 후 24 시간 과다 하게 되어 있는 것을 잘 볼 수 있습니다. 패널에서 m5C 에피레메르아메 조사에 대해 동일한 유형의 분석을 수행 B.In 이 그래프, 모든 비메틸화 시토신은 빨간색으로 표시되고, m5C 메틸화된 사이토신의 비율은 파란색으로 나타났다.
당신이 볼 수 있듯이, PHLPP1, 하이퍼 메틸화 된 세 가지 사이토신 모두 24 시간 후 HIV 감염. 전반적으로, 이 워크플로우는 감염된 세포의 M6A 와 m5C epitranscriptome를 모두 조사할 수 있고 바이러스 성 입자에도 적용될 수 있습니다. 바이러스 감염의 이해는 호스트 epitranscriptomic 풍경을 수정할 수 있습니다 우리에게 규제의 새로운 층에 대한 액세스를 줄 것이다.
바이러스 감염에 대한 차동 메틸화 된 성적 증명서의 조사는 물론 새로운 치료 개입을위한 귀중한 자원을 제공 할 것입니다. 아래 링크에서 시간이 지남에 따라 HIV 감염시 차동 메틸화 된 성적 증명서의 조사를위한 오픈 액세스 리소스를 찾을 수 있습니다.
