유리 가용성 페놀산 조성과 곡물 및 콩과 식물의 항산화 능력을 결정하기위한 일반화 된 방법. 곡물과 콩과 식물을 포함한 전체 곡물은 인간 식단의 상당 부분을 형성합니다. 인간과의 영양 관련성은 오랫동안 인정되어 왔습니다.
그러나, 최근에는 항산화 보호 건강상의 이점이보고되었습니다. 곡물의 외부 곡물 층과 콩과 식물의 종자 코팅에서 발견되는 페놀산은 전체 곡물의 항산화 특성에 기여합니다. 그들은 생체 분자에 산화 적 손상을 일으키는 자유 라디칼을 제거합니다.
전체 곡물에서 발견되는 페놀산의 두 부류는 히드록시벤조산과 히드록시신남산이다. 이 연구는 전체 곡물 페놀산을 추출하고 시험관 내 항산화 능력을 결정하는 간단한 방법을 제공합니다. 이 연구를 위해 다섯 개의 전체 곡물 샘플, 듀럼 밀, 노란 옥수수, 검은 눈 카우완두콩, 콩 및 붉은 신장 콩을 사용하십시오.
전체 곡물 가루 샘플 100 밀리그램을 호박색의 두 밀리리터 용량의 마이크로 원심분리 튜브에 직접 칭량합니다. 튜브의 어두운 색은 혼합물이 빛에 노출되는 것을 방지하는 데 도움이됩니다. 한 밀리리터의 80% 수성 메탄올을 예를 함유하는 각각의 튜브에 첨가한다.
메탄올 용액과 샘플을 혼합하기 위해 간단히 소용돌이친다. 샘플을 60분 동안 초음파 처리하여 유리 가용성 페놀 화합물을 추출한다. 빛으로부터의 추가 보호를 위해 초음파 처리 기간 동안 샘플 위에 덮개를 놓습니다.
초음파 처리 후, 혼합물을 5분 동안 20, 000배 G에서 원심분리하여 고체 잔류물을 침전시키고, 상청액을 상부에 남겨둔다. 유리 페놀 화합물은 원심분리 후 상청액에 존재할 것이다. 상청액은 HPLC 기기에 주입하기 전에 여과되어야 한다.
상층액을 여과하려면 3 mL 주사기의 플런저를 제거하고 주사기 필터를 부착하십시오. 필터의 기공 크기는 0.22마이크로미터보다 크지 않아야 합니다. 상청액의 약 0.4 밀리리터를 주사기 상단에 피펫.
플런저를 다시 넣고 필터를 통해 액체를 바이알 인서트가 들어있는 HPLC 바이알에 밀어 넣습니다. HPLC 분석을 위해 원고에 설명 된 방법을 실행하도록 장비가 설정되면 샘플 목록과 일치하도록 바이알을 회전 목마에로드하십시오. 320 나노미터 및 280 나노미터에서 HPLC 크로마토그램을 구하여 서로 다른 페놀 화합물을 나타내는 뚜렷한 피크를 보여줍니다.
적절한 표준 곡선을 사용하여 하이드록시신남산이 이 파장에서 최대 흡광도를 갖기 때문에 320나노미터에서 정량화합니다. 동일한 원리에 의해, 280 나노미터에서 히드록시벤조산을 정량화한다. 비타민 E의 수용성 유사체인 트롤록스를 표준으로 사용하여 전체 곡물 추출물의 시험관 내 항산화 능력을 추정하십시오.
트롤록스 한 밀리그램의 무게를 팔콘 튜브에 정확하게 칭량합니다. 50% 수성 메탄올 네 밀리리터에 용해시켜 리터당 1밀리몰의 원액을 제조하고, 이는 리터당 1000마이크로몰과 동일하다. 리터당 50, 100, 200, 400, 600 및 800 마이크로몰인 트롤록스의 6개 농도를 준비하여 DPPH 라디칼 소거능 및 트롤록스의 동등한 항산화 용량인 TEAC의 추정을 위한 표준 곡선을 플롯한다.
유사하게, 산소 라디칼 흡광도 용량을 추정하기 위해, ORAC 리터당 6.25, 12.5, 25, 및 50 마이크로몰 트롤록스 농도를 준비한다. 표 하나와 같이 각 농도의 총 부피를 500 마이크로리터로 구성한다. 분석 전에 샘플 추출물을 메탄올로 희석하십시오.
여기에서, 노란 옥수수와 카우완아 추출물을 두 번 희석하였다. 밀과 강낭콩 추출물을 다섯 번 희석한 반면, 대두 추출물은 메탄올로 10배 희석하였다. 8.23 밀리그램의 ABTS를 깨끗하고 2 밀리리터 용량의 호박색 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣으십시오.
다음으로, 1.62 밀리그램의 과황산칼륨을 깨끗하고 2 밀리리터 용량의 호박색 마이크로 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 칭량된 각각의 화학물질을 볼텍싱하여 한 밀리리터의 증류수에 녹인다. 이로 인해 16 밀리몰 ABTS 용액과 6 밀리몰 칼륨 과황산염 용액이 생성됩니다.
ABTS 및 과황산칼륨 용액을 동일한 부피로 혼합하여 ABTS 원액을 제조하였다. 솔루션은 즉시 어두운 색으로 바뀝니다. 이 혼합물을 어둠 속에서 12 내지 16시간 동안 인큐베이션하도록 허용한다.
ABTS 원액을 200밀리몰 인산염 완충 식염수로 30배 희석하여 ABTS 작동 용액을 형성한다. 이렇게하려면 58 밀리리터의 200 밀리몰 PBS를 ABTS 작업 용액 2 밀리리터에 첨가하십시오. 작업 용액은 0.27 밀리몰 ABTS 및 0.1 밀리몰 과황산칼륨을 함유할 것이다.
분석을 위해, 희석된 각 추출물 10 마이크로리터를 96 웰 마이크로플레이트에 넣는다. 190 마이크로리터의 ABTS 작업 용액을 각 웰에 첨가하고 60분 동안 인큐베이션한다. 마이크로플레이트 판독기에서 750 나노미터에서 반응 혼합물의 흡광도를 측정하였다.
리터당 100 ~ 800 마이크로몰 범위의 농도에서 Trolox 표준을 사용하여 보정 곡선을 플로팅합니다. DPPH 항산화제 분석법은 라디칼 생성 화합물인 DPPH를 필요로 한다. 1.2 밀리그램의 DPPH를 빈 15 밀리리터 용량의 원심 분리 튜브에 넣으십시오.
DPPH를 메탄올에 용해시켜 60 마이크로몰 용액을 제조하였다. DPPH 분석은 DPPH에 의해 생성 된 자유 라디칼을 제거하는 샘플 추출물의 능력을 테스트합니다. 다섯 마이크로 리터의 샘플 추출물을 마이크로 플레이트 웰에 넣으십시오.
다음으로, 195 마이크로리터의 60 마이크로몰 DPPH 메탄올 용액을 첨가하고, 60분 동안 인큐베이션한다. 515 나노미터에서 흡광도를 측정한다. Trolox 표준을 사용하여 보정 곡선을 플로팅합니다.
도 하나는 전체 곡물에서 발견되는 히드록시벤조산의 구조를 보여준다. 이 현재의 연구에서, 바닐산은 유일하게 확인된 히드록시벤조산이었다. 도 두 개는 전체 곡물에서 발견되는 하이드록시신남산의 구조를 보여준다.
현재 연구에서 p-coumaric, 카페인 및 페룰산이 샘플에서 확인되었습니다. 표 두 개는 샘플에서 확인된 페놀산을 나타낸다. 앞서 언급한 바와 같이, 바닐산은 샘플에서 확인된 유일한 히드록시벤조산이었다.
카우완두콩 추출물에서만 확인되었다. 하이드록시신남산 카페산은 신장콩에서만 확인되었으며, p-쿠메르산은 노란 옥수수, 카우완두, 콩에서 확인되었다. 페룰산은 모든 샘플에서 확인되었고, 샘플에서 우세한 페놀산이었다.
페놀산의 총 농도는 대두, 카우완두, 노란 옥수수, 및 강낭콩 또는 등가물 순이었고, 그 다음으로 밀이 뒤따랐다. 표 세 개는 시료의 총 페놀 함량 및 항산화 능력을 나타내었다. 항산화 능력은 DPPH 라디칼 소거능, TEAC, ORAC 및 샘플의 총 항산화 능력으로 구성되었습니다.
총 항산화 용량은 DPPH, TEAC 및 ORAC 값의 합이다. 표 두 개와 유사하게, 대두는 가장 높은 총 항산화 능력을 가졌다. 그러나 카우완 대신에 카우완두는 두 번째로 높은 총 항산화 능력을 가진 신장 콩 이었지만 카우완은 두 번째로 높은 총 페놀산 함량을 가졌습니다.
이 변칙성은 개별 페놀산의 구조 및 카우페아에서 히드록시신남산의 항산화 효과에 대한 히드록시벤조산 바닐산의 가능한 길항효과와 관련이 있다. 이 연구는 전체 곡물이 페놀산 조성이 다르다는 결론을 내렸다. 연구 된 전체 곡물 중에서 콩은 페놀산의 총량이 가장 많으며 그에 상응하여 항산화 능력이 가장 높습니다.
