사카리박테리아는 적절한 숙주 박테리아와 공동 배양을 필요로하는 필수 기생충입니다. 인간 구강 사카리박테리아는 알려진 숙주 세균 종을 사용하여 대부분의 개인을 위해 쉽게 격리될 수 있기 때문에. 이 프로토콜은 모든 조사자 또는 실험실이 이진 공동 배양에서 자신의 균주를 격리 할 수 있습니다.
이 기술은 대부분의 미생물 실험실에 존재하는 간단한 장치 및 장비를 사용하고 성공적으로 사카리박테리아의 6 종을 나타내는 30 개 이상의 격리를 배양하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 적절한 활성소균 숙주를 식별하고 분리할 수 있는 경우 다른 후보 추적 방사선 종뿐만 아니라 다른 환경 및 기타 포유류로부터의 사카리박테리아의 격리에 유용할 수 있다. 절차를 시연하는 것은 앤드류 콜린스, 내 실험실에서 전 박사 후 동료가 될 것입니다.
시작하려면 거미성 프로니키카와 같은 숙주 박테리아의 배양을 시작하여 초기 고정 단계로 성장할 수있는 충분한 시간을 가지고 있습니다. 문화를 개시하기 위해, 거미성 프로니키아와 0.1%효모 추출물을 함유한 트립틱 콩 육수 2~5밀리리터를 접종하고 24시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다. 다음으로 트랙 에칭 0.2 마이크로미터 필터 멤브레인필터 홀더를 조립합니다.
원심분리기 튜브및 캡 어셈블리와 함께 호일에 싸서 오토클레이빙으로 소독합니다. 비멸 표면과 우발적으로 접촉하는 경우 추가 소모품을 살균하십시오. 잇몸 라인을 따라 긁어 내고, 멸균 종이 점, 우아한 곱슬거또는 멸균 된 이쑤시개 또는 파이펫 팁을 사용하여 치과 플라크를 수집하고 MRD 또는 PBS와 같은 적절한 버퍼로 옮길 수 있습니다.
더 이상 진행할 준비가 될 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 작은 파이펫 팁으로 소용돌이와 파이펫팅의 조합을 사용하여 치과 플라크를 적극적으로 다시 중단한 다음 MRD 버퍼 9밀리리터를 포함하는 튜브에 다시 매달린 플라크 샘플을 추가합니다. 무균 기술을 사용하여 멸균 필터 어셈블리를 조심스럽게 풀수 있습니다.
분기 회전을 풀고 필터 홀더를 다시 조여 스레드가 제대로 관여되고 장치가 제대로 닫히도록 합니다. 주사기를 사용하여 장치를 통해 MRD 버퍼 10 밀리리터를 전달하여 멤브레인을 세척합니다. 세척된 필터에 샘플을 적용하려면 주사기에서 플런저를 제거하고 필터 장치에 부착합니다.
여과 장치를 필터 아래에 멸균 원심분리기 튜브를 놓고 분산된 치과 샘플을 주사기에 붓고 필터에 적재합니다. 그런 다음 플런저에 가벼운 압력을 가하여 샘플을 필터를 통과합니다. MRD 버퍼의 또 다른 10 밀리리터로 멤브레인을 세척하고 여과된 시료와 동일한 튜브로 흐름을 수집합니다.
그런 다음 튜브를 무균으로 캡하고 얼음을 유지합니다. 원심 분리 후 세포 펠릿의 위치를 식별하기 위해 튜브와 캡에 방향 표시를 확인합니다. 상부에 마크가 있는 고속 원심분리기에 튜브를 놓고 샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 60G, 000 G의 원심분리기로 놓습니다.
원심 분리 후, 조심스럽게 상체를 부어 튜브의 상단에 펠릿을 유지합니다. 그런 다음 적극적으로 소용돌이에 의해 MRD 버퍼의 1 ~ 2 밀리리터에 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 적절한 성장 매체의 두 밀리리터를 튜브에 알리싱하여 배양 튜브를 준비합니다.
그런 다음 숙주 유기체의 하룻밤 문화의 200 마이크로리터와 각 튜브에 100~200개의 미세리터를 재일시 중단된 여과시로 추가합니다. 숙주 유기체에 적합한 조건하에서 결합된 샘플을 배양한다. 새로운 튜브에서 신선한 성장 배지의 2 밀리리터로 이진 배양의 200 마이크로리터를 전송하여 2 ~3 일마다 세포를 통과.
통과 된 배양이 감염되지 않은 숙주 문화의 200 마이크로 리터에서 성장을 보여주지 않으면 세포를 통과할 때 접종 된 튜브를 인큐베이터로 반환합니다. 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 PCR 마스터 믹스의 알리따옴표 24 마이크로 리터. 사카리박테리아 감염 배양의 한 마이크로리터에서 튜브를 열 사이클러에 놓습니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 PCR 프로그램을 설정합니다. 1% 아그로스 젤로 PCR 제품을 로드하고 실행합니다. 약 600 개의 기지의 밴드는 사카리박테리아의 존재를 확인합니다.
양성 배양의 순도를 확인하기 위해 멸균 완충제에서 사카리박테리아의 공동 배양에 대한 10배 연속 희석을 수행하고, 100마이크로리터를 한천 판에 퍼뜨리도록 한다. 적절한 성장 조건하에서 문화를 배양하고 오염 유기체를 관찰한다. 약 600 개의 기지의 밴드는 사카리박테리아의 존재를 확인합니다.
PCR 검출은 사카리박테리아 공생의 낮은 수 때문에 초기 감염 배양에서 부정적인 나타날 수 있습니다. 그러나 몇 구절 후에 강력한 PCR 제품이 나타나므로 안정적인 감염이 발생했음을 나타냅니다. 동일한 사카리박테리아 여과와 여러 호스트 종을 테스트하는 것은 일반적으로 낮은 성공률을 가질 것이다.
공생 호스트 상호 작용은 매우 구체적입니다. 감염된 배양이 증가함에 따라 정상적인 탁탁증 성장이 나타나야 합니다. 공생이 확립됨에 따라 감염된 배양은 감염되지 않은 숙주 생물의 배양보다 덜 탁탁하게 됩니다.
오염된 배양은 도금 후에 감염된 식민지를 따기로 정해질 수 있습니다. 감염된 식민지는 때때로 감염되지 않은 식민지에 비해 불규칙한 식민지 모양에 의해 확인될 수 있습니다. 일반 식민지의 비율은 이진 배양에서 사카리박테리아의 티터에 따라 달라집니다.
티터가 낮으면 불규칙한 식민지가 적어 감염된 식민지를 쉽게 선택하고 순수한 이진 문화를 시작할 수 있습니다. 문화는 여러 구절에 대해 긍정적으로 나타나지 않을 수 있습니다. 그래서 몇몇 환자는 필요할 것입니다.
또한 이진 문화의 오염을 정기적으로 검사할 필요가 있습니다. 이진 배양은 모든 종류의 실험실 실험에 사용할 수 있습니다. DNA와 RNA는 게놈 시퀀싱 및 전사 분석을 위해 각각 추출될 수 있다.
병원성 또한 동물 모델을 사용하여 조사 될 수있다.
