이 포괄적인 프로토콜은 다양한 오줌 박테리아의 가까운 게놈을 생성하는 방법을 지시하고 코딩 경험이없는 독자가 말기 기반 게놈 조립 및 분석 파이프 라인을 성공적으로 구현 할 수 있게합니다. 완전한 게놈 어셈블리는 교만및 비뇨기생 박테리아 중 식민지화 및 독성에 기여하는 유전자의 발견을 가능하게 합니다. 가까운 게놈은 게놈 아키텍처및 모바일 유전 요소에 대한 통찰력을 제공합니다.
하이브리드 게놈 조립 방법은 다른 해부학 적 사이트 또는 환경 틈새 에서 분리 된 모든 컬처 박테리아에 적용하여 게놈 함량 및 아키텍처에 유사한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 프로토콜 및 제조업체 가이드를 따라 이중 좌초 된 DNA 풀을 준비하고 DNA 풀에 파라자성 구슬의 2.5 배를 추가한 다음 튜브를 부드럽게 가볍게 쓸어 서 내용내용을 혼합하여 정리하십시오. 샘플을 2, 000회 G로 잠시 회전하고 실온에서 5분 동안 회전에 샘플을 배치한 다음 자석에 구슬을 밀어 넣는다.
다음으로, 펠릿을 방해하지 않고 뉴클레아제 없는 물에 70%에탄올을 새로 준비한 250마이크로리터로 펠릿을 두 번 씻는다. 세차하는 동안 튜브를 자석에 둡니다. 각 세척 후 에탄올을 흡입한 다음 2, 000회 G에서 샘플을 잠시 회전한 다음 자석으로 되돌림합니다.
파이펫은 잔류 에탄올을 벗겨내고 펠릿이 30초 동안 건조할 수 있도록 합니다. 일단 건조되면, 뉴클레아제없는 물의 60 ~ 70 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 2 분 동안 실온에서 샘플을 배양 한 다음 엘루트가 명확해질 때까지 자석에 샘플을 펠릿하십시오. 엘테를 깨끗한 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
플루오로미터를 사용하여 농축 된 이중 좌초 DNA 풀을 정량화한 다음 65 마이크로 리터 최종 부피로 샘플700 나노그램의 알리쿼트를 준비하여 어댑터 결찰 단계로 진행하고 첫 번째 실행이 완료된 후 두 번째 실행을 위해 4도에서 풀의 나머지 부분을 유지합니다. 제조업체 지침에 따라 어댑터 리그레이션을 계속합니다. 시퀀싱을 진행하려면 프라이밍 버퍼를 혼합하고 유동 셀을 누를 수 있습니다.
DNA 라이브러리 솔루션을 준비하고 샘플을 로딩 포트에 드롭방향으로 로드합니다. 시퀀싱 실행을 시작합니다. 시퀀싱을 위해 운영 소프트웨어를 열고 시작 버튼을 클릭한 다음 실험이름을 입력합니다.
키트 선택을 계속하여 사용 중이던 적절한 라이브러리 준비 키트 및 바코드 확장 팩을 선택한 다음 계속 실행 옵션을 클릭합니다. 두 번째 실행을 위해 충분한 라이브러리를 준비하려는 경우 실행 길이를 기본 값 72시간에서 48시간으로 조정하고 계속 베이스콜을 누릅니다. 빠른 베이스콜을 통합하여 베이스 콜링 옵션을 확인합니다.
출력 FASTQ가 바코드 시퀀스에서 트리밍되고 바코드를 기반으로 별도의 디렉터리로 멀티플렉싱을 해제할 수 있도록 바코드를 사용하도록 설정합니다. 출력을 계속 클릭합니다. 다음으로 출력 시퀀싱 데이터를 저장할 위치를 선택합니다.
FASTQ 출력을 절약할 경우 FASTQ 출력과 500기가바이트 이상의 데이터만 절약하면 약 30~50기가바이트의 데이터를 기대할 수 있습니다. 시퀀싱 후 수동 필터링을 진행할 계획이라면 필터링 옵션 Qscore 7을 필터링되지 않은 읽기 길이로 선택 해제합니다. 그렇지 않으면 옵션을 선택합니다.
설정 탭을 계속 실행하여 모든 설정을 검토합니다. 설정이 올바른 경우 시작 단추를 클릭합니다. 다른, 필요한 조정을 다시 클릭 합니다.
긴 읽기 디렉터리에서 실행에 사용되는 각 바코드에 대한 새 디렉터리를 만듭니다. 각 바코드에 해당하는 모든 fastq 파일을 적절한 폴더에 복사합니다. 모든 실행에서 각 바코드에 대한 모든 fastq 파일을 결합합니다.
파일이 결합되면 터미널을 열고 CD 명령을 사용하여 긴 읽기 디렉터리 내의 바코드 디렉토리로 이동합니다. 바코드당 모든 fastq 파일을 단일 패스트크 파일에 연결하려면 명령을 실행하고 각 바코드에 대한 절차를 반복합니다. NanoStat를 사용하여 명령을 실행하여 샘플의 읽기 품질을 평가한 다음 출력을 텍스트 또는 Word 파일로 복사하여 결과를 기록하여 향후 참조를 확인할 수 있습니다.
결과가 저장된 후 NanoFilt를 사용하여 MinION 읽기를 필터링하고 명령을 실행하여 7개 미만의 Q와 길이가 200개 미만인 읽기를 폐기합니다. 생성된 트리밍 된 파일에서 명령으로 NanoStat를 실행합니다. 출력을 텍스트 또는 Word 파일로 복사하여 결과를 기록하고 이전 결과와 비교하여 필터링이 성공되었는지 확인합니다.
시퀀싱 실행에 사용되는 각 바코드에 대한 단계를 반복합니다. 하이브리드 게놈 어셈블리를 생성하기 위해 짧은 읽기 파일과 긴 읽기 파일을 trimmed_reads라는 단일 디렉토리로 구성합니다. 따라서 디렉토리에는 이전에 생성된 fastq가 포함되어 있습니다.
긴 읽기와 두 개의 fastq에 대한 gz 파일. gz 파일R1 및 R2로 트리밍 된 짧은 읽기. 터미널에서 CD 명령을 사용하여 읽기 파일을 저장하는 디렉터리 trimmed_reads 이동합니다.
올바른 디렉토리에 들어가면 두 개의 짧은 읽기 파일을 압축하여 fastq에 저장합니다. 명령을 실행하여 gz 형식입니다. R1과 R2 모두에 대한 단계를 반복합니다. 모든 읽기 파일이 패스트크에 있는지 확인합니다.
gz 형식및 모든 파일이 동일한 격리와 일치하는지 확인합니다. 명령을 실행하여 유니사이클러를 사용하여 하이브리드 어셈블리를 시작합니다. 실행이 완료되면 외발 자전거를 검토합니다.
오류를 보장하기 위해 파일을 로그합니다. 생성된 컨텍스트의 숫자, 크기 및 완전하거나 불완전한 상태를 기록합니다. 유니사이클러 로그에서 불완전한 컨텍스트가 식별되면 명령에 플래그를 추가하여 굵은 모드에서 외발 자전거를 다시 실행합니다.
붕대를 열고 파일을 클릭한 다음 로드 그래프를 선택하고 어셈블리를 선택합니다. 이전에 유니사이클러에 의해 생성 된 unicycler_output_directory 저장 된 gfa 파일. 파일이 로드되면 왼쪽 도구 모음의 그리기 그래프 단추를 클릭하고 연속적이 어떻게 연결되고 구성되는지 검사하여 어셈블리가 완료되었는지 평가합니다.
단말 내에서 CD 명령을 사용하여 유니사이클러 출력을 저장하는 폴더로 이동합니다. 그런 다음 명령을 실행하여 쿼트 프로토콜을 실행합니다. 출력 디렉터리 quast_output_directory 쿼에서 생성된 보고서를 검토합니다.
단말 내에서 CD 명령을 사용하여 유니사이클러 출력을 저장하는 폴더로 이동한 다음 명령을 실행하여 prokka를 실행합니다. tsv 테이블을 열고 시퀀스 분석 소프트웨어에 생성된 gFF 파일을 업로드하여 주석을 검토합니다. 소프트웨어의 주석을 시각화하고 분석합니다.
대표적인 젤 이미지에서 게놈 DNA 또는 gDNA 추출 결과가 묘사됩니다. 손상되지 않은 gDNA의 성공적인 추출 및 분리를 관찰할 수 있다. 단편화된 gDNA 및 RNA 오염을 보여주는 실패한 추출도 묘사됩니다.
박테리아의 게놈 조립 그래프는 유니사이클러 하이브리드 드 노보 어셈블리에 의해 생성되고 붕대에 의해 시각화되었다. Klebsiella oxytoca KoPF10의 완전한 게놈은 단 하나 폐쇄염색체 및 Klebsiella 폐렴 KpPF25의 완전한 게놈이 닫힌 염색체와 5개의 닫힌 플라스미드로 이루어져 있음을 보여주었습니다. Klebsiella 폐렴 KpPF46의 불완전한 염색체는 두 개의 상호 연결된 연속으로 이루어져 있었습니다.
클레브시엘라 옥시토카 KoPF10과 Klebsiella 폐렴 KpPF25의 완전한 게놈에 대한 제너리어스 프라임에 의해 생성 된 조립지도는 플라스미드 백본을 따라 색깔의 화살표에 의해 표시 된 불음 유전자를 보여주는. 흐름 셀 로드가 성공적이도록 권장 설정을 사용하여 긴 읽기를 필터링하고 모든 파일이 fastq에 있는지 확인합니다. gz 형식입니다.
동일한 샘플에 속한 파일을 사용하여 올바른 유니사이클러 명령을 실행합니다.
