이 문서에 제시된 방법은 BBSRC BB / 재정 지원 사업에서 발생 I021507 / 1 (TB, RJTW)와 MRC 박사 재학 (MH).

참고 : 모든 실험은 킹스 칼리지 런던, 영국, 영국 홈 오피스 동물 보호 지침에 따라 수행되었다. E14 소뇌 1. 해부 <ol><li> 배아의 날 (14)에 38 ° C에서 갈색 수정 된 암탉 &#39;계란을 품어. </li><li> 사용 계란 가위 비켜에서 병아리 배아 목을 벨과 얼음 차가운 PBS (그림 1A)를 포함하는 페트리 접시에 머리를 제거합니다. </li><li> 표준 집게를 사용하여 눈과 위턱을 제거, 조직을 통해 각각의 눈 뒤에있는 모든 방법을 절개합니다. 모든 방법 아래턱 (그림 1B)를 제거 인두를 통해 두 번째 절개를합니다. </li><li> 표준 집게를 사용하여 (그림 1C을)를 벗겨하여 두개골의 표면에서 모든 피부를 제거하고 뇌를 공개, 정면 및 정수리 뼈를 제거합니다. </li><li> 복부 측면에서, 인두 연골 및 보조 중간 엽을 제거합니다. </li><li> 등의 측면에서,주의LY는 PIA, 별도의 전체 뇌 (그림 1D)를 손상하지 후뇌 돌보는에 간엽 지느러미를 제거합니다. </li><li> 모든 방법 중뇌와 후뇌와 소뇌 (그림 1E)를 포함하여 별도의 후뇌 사이의 조직을 통해 절개를합니다. </li><li> 모든 방법 소뇌와 후뇌의 ALAR 판의 양측 접합부의 조직을 통해 절개를함으로써, 절개에 걸쳐 PIA의 무결성 (그림 1 층)을 유지하기 위해주의하면서 전체 소뇌를 제거합니다. 성형 맥락총 (그림 1G)를 제거합니다. </li><li> 얼음 차가운 HBSS로 해부 소뇌를 이동합니다. </li></ol> E14 소뇌 2. 슬라이스 문화 <ol><li> 주걱이나 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 헬기의 멸균 플랫폼 전체 소뇌로 이동시켜 조리개를 확대하기 위해 절단. 피펫을 사용하여 물기를 제거합니다. </li><li> T의 전체 전체 소뇌를 잘라그는 최대 50 % 절삭 속도 설정 한 조직 헬기를 이용하여 300 μm의 두께로 방향을 요구했다. 조직의 무결성이 가장 쉽게 시상 절에 보존된다 그러나, 배향은 또한 세포 분석을위한 중요한 고려 사항이다 (과립 세포 축삭 횡 실행 동안 조롱박 세포 수지상 sagittally 조롱박 수지상 세포의 평면에 수직 정렬된다). </li><li> 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여, 얼음의 슬라이스 소뇌 차가운 HBSS를 다룹니다. </li><li> 컷 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음 차가운 신선한 HBSS를 포함하는 60mm 페트리 접시에 HBSS에 조각을 전송합니다. </li><li> 광섬유 광원으로 조명 해부 현미경, 시계공 겸자를 사용하여 개별 조각의 분리를 보장한다. 슬라이스를 식별하는 것은 자신의 조직 무결성 및 메디 오 - 측면 위치에 따라, 전기 천공한다. 참고 : 배지에서 배양 슬라이스를 통해 배아에서 각각의 해부는 약 10 ~ 20 분 따라 우포늪 소요N 경험. 그 소뇌가 잘린 및 생체 문화 사이의 최소 시간을 보낼 수 있도록 한 번에 해부 하나를 수행합니다. </li></ol> 조각의 3 Electroporation에 <ol><li> 절연 테이프로 60mm 페트리 접시의 바닥에 electroporator의 양극을 고정하여 전기 챔버를 구축합니다. 전극을 커버하는 HBSS의 약 1 ML을 추가합니다. </li><li> HBSS에 덮여 전극의 상단에 0.4 μm의 문화 삽입을 놓습니다. 문화 삽입 전극이 항상 삽입과 전극 사이가 접촉되어 있는지 확인하기에 휴식을 허용합니다. 주 :이 설정에서는 슬라이스 배양 인서트 서킷을 유지하지만, 음극의 표적화를 허용 공간, 용액의 표면에 나머지 것이다. </li><li> 전송 확인 조각 (문화 삽입 당 최대 5) 절단 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 문화 삽입 상. 분리 및 sagitt 문화 삽입에 정착 할 수 있도록알 방향입니다. </li><li> 슬라이스가 더 이상 용액에 목욕을하지 않도록 피펫을 사용하여, 초과 HBSS 제거합니다. </li><li> 조각의 대상 영역의 표면에 20 % 빠른 그린으로 희석 (1 μg의 / μL의 농도) P10 피펫 팁, 피펫 DNA를 사용. 20 % 빠른 그린은 점성 DNA 용액을 보장하고 엄청나게 DNA의 넓은 분산을 방지 할 수 있습니다. 각각의 조각 (그림 2B)에 약 5 μL DNA / 빠른 그린 솔루션을 추가합니다. </li><li> 원하는 대상 조직을 통해 음극를 놓고 3 × 10 V, 10 밀리 초 지속 펄스 electroporate. 조직과 음극의 직접적인 접촉을 피하십시오. 대신 컨덕턴스를 유지 (실제로 조직에 닿지 않으면 서 가능한 한 조직에 가까운 음극 배치)하는 액체의 표면 장력을 이용한다. </li><li> 원하는대로 각각의 소뇌 조각에 EGL의 여러 지역에 DNA 전달 및 전기를 반복합니다. </li><li> 일렉트로 완료, 전송 배양시 INSE30mm 페트리 접시에 체류. </li><li> 글루코오스 1 % B27 보충제, 2 mM의 글루타민, 100 U가 / ㎖ 페니실린 - (+) - 각각의 배양, 미리 예열 배지 (기초 배지 이글 1 ㎖, 0.5 % (w / v)의 D를 추가 배양 인서트 매체와 접촉하지만, 슬라이스가 목욕하지되도록 배양 인서트 아래 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신). </li><li> 최대 3 일 동안 37 ° C / 6 % CO 2의 문화를 품어. 배지 신선한 사전 예열 매체 매 24 시간을 모두 교체합니다. </li><li> 문화가없는 문화 미디어와 신선한 30mm 접시에 (4 ° C에서 또는 O / N) 4 % 파라 포름 알데히드에서 1 시간 동안 삽입에 문화에 따라, 슬라이스를 수정합니다. </li></ol> 소뇌 조각 4. 영상 <ol><li> 고정 후, PBS에서 5 분 동안 조각을 3 회 반복한다. </li><li> 면도날을 사용하여, 주위 슬라이스 절단하고 조각에 부착되는 인서트의 영역을 제거하여 배양 인서트에서 각 일렉트로 배양 소뇌 슬라이스 해부. 해야 할 것문화 삽입 표면에서 슬라이스를 제거하려고하지. </li><li> 커버 슬립 돌보는에서 원하는 경우 DAPI를 포함하는 설치 매체의 약 1 ml의 마운트 슬라이스 거품을 소개하지, 이미지는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여. 주 : 이미징 파라미터들이 전기 천공 구조에 따라 다양하고, 개별 사용자의 재량에 따라 할 수있다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에보고 된 프로토콜은 해부 electroporating 및 병아리 배아로부터 14 일째 소뇌의 슬라이스를 배양하기위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 개별 소뇌 로브의 고립 된 타겟팅을 포함하여 EGL의 작은 초점 지역에 전기의 대상으로 할 수 있습니다. 그것은 높은 해상도와 편의에 따라 유전자 분석 및 이미징을 가능하게하고, 저렴한 비용으로 설치류 43-47 년에 설립 된 기술에 비해. 이러한 분...

소뇌는 후뇌의 앞쪽 끝 부분에 앉아 성숙한 뇌의 감각 및 모터 처리의 통합에 대한 책임뿐만 아니라 더 높은인지 과정 (1)을 조절하는 것입니다. 포유류와 조류, 그것은 성인의 뇌에서 신경 세포의 절반 이상을 생산하고 개발하는 동안, 조상의 광범위한 대중 교통 증폭의 제품을 정교한 형태를 보유하고 무겁게 잎 모양입니다. 소뇌는 수세기 동안 신경 생물 학자과 분자 시대 연구의 대상이되어왔다 마찬가지로 상당한 관심을 받고있다. 이는 본질적으로 흥미로운 생물학뿐만 아니라이 많이와 같은 가장 일반적인 소아 두뇌 자폐증 스펙트럼 장애 (2) 가장 눈에 띄게 소뇌 암, 수 모세포종 3, 등의 발달 유전 질환을 포함하여 인간의 질병에 연루되어 있다는 사실뿐만 아니라 관련 종양. 중요한 것은 WH 내의 우수한 모델 시스템이며무형 문화 유산은 두뇌 발달 4시에 운명 할당 및 신경을 연구한다. 최근에는 또한, 척추 동물 계통 5-10 걸쳐 본 소뇌 형태의 다양성으로 인하여 큰, 뇌 발달의 비교 연구를위한 모델 시스템으로 구축되었다. 소뇌는 후뇌 11 rhombomere 1의 등 반에서 개발하고 발달 두 가지 기본 전구 인구, 마름모꼴 입술과 심실 영역으로 구성되어 있습니다. 마름모꼴의 입술은 지붕 판과의 국경에있는 후뇌의 neuroepithelium의 등 주변 지역 확장합니다. 그것은 소뇌 12-14의 글루타메이트 흥분성 신경 세포의 발상지입니다. 심실 영역은 가장 눈에 띄게 억제 GABA 성 소뇌 신경 세포, 큰 조롱박 신경 세포 (14, 15)을 발생시킨다. 나중에 개발 (마우스의 배아 일 13.5 약에서, 병아리 16 E6), 글루타메이트의 progen마름모꼴적인 억제제는 립으로부터 접선 마이그레이션의 선조 PIAL 층을 형성 : 보조 선조 존 외부 과립 층 (EGL)라고. 이는 성숙한 뇌에서 발견되는 과립 뉴런의 거대한 수 리드 광범위한 중계 증폭을 겪는다이 층이다. EGL의 확산은 긴 세포주기 종료하고 중앙으로 외부 EGL 층에서 자신의 종료와 관련되는 전구 세포의 신경 세포 분화에 스위치, 마름모꼴 립 (17)에서 접선 마이그레이션의 결과 하위 PIAL 위치에 연결되었습니다 EGL (18). 중간 - 가로축에 후 유사 분열 과립 세포의 광범위한 접선 마이그레이션 성숙한 소뇌 피질의 내부 과립 층에 최종 반경 마이그레이션하기 전에, 중간 및 내부 EGL (19)에서 발생합니다. 소뇌 표면 마름모꼴 입술에서 세포의 마이그레이션 피아 20-22에서 CXCL12 신호에 따라 달라집니다 </sup&gt; 및 과립 세포 CXCL12 수용체 CXCR4를 발현. 그들의 접선 마이그레이션 억제 interneuron 인구 23-25 ​​마이그레이션 신피질 접선 방향으로의 그 때문에 연상시킨다. 흥미롭게도, 전자 현미경 연구 (17)는 증식 형태와 EGL 세포는 포유류의 피질 (26)의 기초 선조를 연상시키는 방식으로 증식 능력과 세포의 동작을 연결, PIAL 접촉을 유지한다고 제안했다. 이것은 18 시그니처 과립 전구체 별개의 유전자 발현이 뚜렷한 세포 외 환경에 의해 정의되는 세 개의 부 계층으로 EGL의 전술 한 층화에 반영된다. oEGL에서 증식 전구 세포의 전구 세포가 개별적 유전자 생쥐 배아 발달의 마지막에 표시 될 때, 그들은 postmitotic 250-500 g의 중앙값의 평균을 야기하도록 클론 크기의 정규 분포로 발생ranule 뉴런 (27, 28). 확산은 조롱박 뉴런 29-32의 기초에서 분열 쉬이 잇 신호에 따라 달라집니다. SHH에 응답하는 능력이 전사 인자 Atoh1의 세포 발현에 따라 자율적 전적으로 의존하는 것으로 밝혀졌다, 시험 관내 및 생체 내 (33) (34, 35)의 양쪽 모두. 이와 마찬가지로 세포주기 출구와 분화 가능성 Atoh1 37의 직접 리프레이다 하류 전사 인자 NeuroD1 36의 발현에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 세포주기 출구 38-42의 세포 생물학적 근거를 해독이 진행하고, 상당한 발전에도 불구하고, 결정을 기초 근본적인 분자 메커니즘 (들)은 세포주기를 종료 및 분화 신경 세포에 선조에서 전환하고, 내부 EGL에서 관련 postmitotic 접선 마이그레이션뿐만 아니라 나중에 스위치방사형 마이그레이션 이해 불완전하게 남아있다. 이는 EGL의 실험 다루기 힘듦의 큰 정도이다 늦은 개발과 같은 신경성 분자의 많은 중요한 앞서 과립 전구체의 삶에서 마름모꼴 립에서 또한 때문에 유전자 타겟팅하기 어렵다. 이 문제를 극복하기 위해, 다수의 저자는 설치류 43-48에서 출생 후 소뇌를 대상으로하는 방법으로 생체와 생체 전기에서 개발했습니다. 여기에, 우리는 비용과 편의성면에서 상당한 이점을 나타내는 EGL을 공부 병아리에 생체 전기의 사용을 개척. 전기와 병아리 소뇌 조직의 생체 슬라이스 문화의 우리의 방법은 14 병아리 EGL 증식의 절정에 배아 날로부터 조직 해부 사용합니다. 이 방법은 마름모꼴 립의 독립적 EGL 유전자의 표적화를 허용하고 과립으로부터의 전이 유전자 해부 스테이지를 설정한다소뇌에 postmitotic 과립 신경 세포에 전구.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

소뇌 외부 과립 층 (EGL)이 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트 및 신경 세포의 증식 및 분화 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 또한, 자사의 증식 능력의 진화 적 수정은 소뇌 척추 동물의 뇌의 EVO-DEVO 연구를위한 훌륭한 모델을 만들고, 양막 류 (amniotes)에서 소뇌 크기의 극적인 확장을위한 책임이있다. EGL의 구성 세포, 소뇌 과립 전구 세포는 또한, 수 모세포종에 대한 가장 일반적인 소아 종​​양 신경 기원의 상당한 셀을 나타낸다. 교통 증폭 다음, 과립 전구체은 성숙한 포유류의 뇌에서 가장 큰 신경 인구를 대표하는 소뇌의 내부 세분화 된 계층에 반경 방향으로 이동한다. 병아리, EGL 증식의 피크는 임신의 두 번째 주 끝으로 발생합니다. 이 층에서 유전 적 변형을 타겟팅하기 위해서확산의 피크, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 소뇌 조각의 생체 전기를 통해 유전자 조작하는 방법을 개발했다. 이 방법은 생체 내 과립 신경 발달의 여러 중요한 양상을 되풀이되었습니다 소뇌 과립 세포 증식 및 분화에 대한 철저한 이해를 생성하기에 유용 할 것이며, 따라서 소뇌 개발, 질병의 진화.

이 섹션에서는 배아의 날 (14) 병아리에서 슬라이스 전기 및 소뇌의 문화를 사용하여 얻을 수있다 결과의 예를 보여줍니다. 소뇌의 박리는도 1에 도시되어 설정 일렉트로 포 레이션 챔버는도 2에 도시되어있다. 우리가 성공적으로 시험 관내에서 (도 3a)을 그 구조 및 셀룰러 모폴로지를 유지 배양 소뇌 슬라이스, electroporate 및하?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K 조회수.  King's College London.  소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다. 

비디오: Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

최적화<em&gt; 전 비켜</em&gt; 개발의 고급 단계에 병아리 배아의 배양

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

심 외막 파생물 문화 분석 및<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

설치류 태 반의 전 생체 관류

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

성체 얼룩말 기피 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA의 생체 내 전달을 위한 전기 개공 방법

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...