워크플로우는 엄격하게 통제된 환경 조건에서 세포를 성장시키고, 용해/얼음을 사용하여 빠르게 냉각하고, 포름알데히드와 잠복시간의 미리 최적화된 농도로 고정하는 것으로 구성됩니다. 고정 반응은 글리신 또는 트립스와 같은 1 차적인 아미노산 군 함유 화합물의 과잉을 사용하여 담금질됩니다. 세포는 수집, 세척 및 냉동 저장 될 수있다.
고정 된 세포는 기계적 또는 화학적으로 용해 될 수 있으며, 용액은 분자 크기, 퇴적 물 특성 또는 친화성 마커에 따라 리보소말 분획의 분리에 사용됩니다. 이 접근법은 면역 보조 정제 및 검출, 전자 현미경 검사법의 특정 인자를 포함하는 복합체의 농축을 위해 사용할 수 있는 다목적 물질을 초래합니다. 교차 연결 된 깊은 차단, RNA 증폭 또는 혼성화 기반 분석, RNA 염기서열 분석 및 질량 분석 가능 해집니다.
600 나노미터에서 0.05 광밀도를 사용하지 않는 시궤도 셰이커에 1리터 효모 배양을 설정하고 30°C에서 펩톤및 덱스트로스 미디어를 사용합니다. 섭씨 4도에서 효모 세포의 액체 현탁액을 5000 G에서 펠렛을 위한 호환 가능한 로터 및 원심분리기 병과 미리 접전된 원심분리기를 설치합니다. 성장하는 셀의 광학 밀도기록을 보관하십시오.
기하급수적 성장 단계가 관심 있는 경우 수집 시 0.6~0.8나노미터와 600나노미터 사이여야 한다. 세포가 준비되면 250 그램의 깨끗한 분쇄 된 물 얼음이 들어있는 베이커가있는 화학 연기 후드 내부에 아이스 박스를 설치하고 25 밀리리터 트립신과 갓 구입한 메탄올이 후드 내부에 37 % 포름알데히드 솔루션을 안정화시켰습니다. 얼음이 들어 있는 제빵사에 최신 세포 배양을 붓습니다.
그런 다음 얼음이 녹을 때까지 혼합물을 강렬하게 저어 볼륨보다 2.2 %의 무게의 최종 농도에 37 %의 포름알데히드의 75 밀리리터를 추가합니다. 얼음이 녹으면 10분 동안 타이머를 설정하고, 미리 냉각된 원심분리기 병으로 배양을 옮기고 세포를 원심분리로 5분 동안 원심분리하여 전달합니다. 스핀이 있는 동안, 50 밀리리터 튜브를 미리 식히고 얼음에 남아있는 포름알데히드를 중화하기 위해 글리신을 함유하는 갓 준비된 버퍼 A를 유지합니다.
원심분리 후 원심분리관을 얼음 위에 놓고 펠릿 쪽을 얼음과 접촉합니다. 튜브를 연기 후드에 넣고 상체를 포름알데히드 폐기물 용기에 넣습니다. 25 밀리리터 스트리펫을 사용하여 버퍼 A의 20 밀리리터에서 오래된 튜브에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 50 밀리리터 튜브로 이송합니다.
버퍼 A로 40 밀리리터로 부피를 구성하고 섭씨 4도, 5000 G의 원심분리로 세척 세포를 5분 동안 수집합니다. 상체를 버리고 40 밀리리터 버퍼 A에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하며, 이는 글리신 오염을 제거하기 위해 글리신을 함유하지 않는 버퍼 A입니다. 펠릿은 섭씨 4도, 5000 G 5분에서 원심분리로 세포를 다시 합니다.
버퍼 A로 한 번 더 세서히를 반복합니다. 상체를 버리고 세포 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 펠릿으로 튜브의 무게를 측정하고, 젖은 세포 질량은 세포 배양의 1 리터 당 약 1 그램이어야한다.
액체 질소가 있는 알루미늄 호일로 늘어선 상자에서 약 3cm 깊이까지 폴리스티렌을 채웁니다. 상자에 50 밀리리터 튜브를 똑바로 세워 놓습니다. 10초 동안 피펫팅 및 소용돌이를 통해 버퍼 A 2의 550 마이크로리터에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
마이크로리터 RNase 억제제당 40단위의 마이크로리터 10대를 10초 동안 다시 첨가합니다. 1 밀리리터 파이펫을 사용하여, 액체 질소를 포함하는 50 밀리리터 2에 세포 현탁액을 드립. 다음 단계를 준비하기 위해 드라이 아이스에 1.5 밀리리터 핵 프리 튜브와 10 밀리리터 스테인레스 스틸 연삭 항아리를 미리 식힙니다.
냉동 셀 서스펜션 액적을 깨끗한 멸균 주걱을 사용하여 항아리에 옮기습니다. 연삭 항아리를 액체 질소에 1분 동안 담그고 액체 상이 접합부 위에 유지되도록 합니다. 27 Hertz에 Cryo 믹싱 밀을 설치하여 1분 동안 교반합니다.
믹서 밀에서 1 분 동안 27 Hertz에서 밀봉 된 연삭 항아리를 교반하십시오. 항아리를 액체 질소로 다시 냉각시키고 1 분 더 흔들어 주세요. 항아리를 1.5 밀리리터 핵 프리 튜브와 함께 드라이 아이스가 들어 있는 얼음 상자로 옮길 수 있습니다.
작은 강철 주걱을 사용하여 패딩 된 갈기 날짜를 튜브로 옮기. 그런 다음 튜브를 영하 80도에 보관하십시오. 두 개의 T175 플라스크에서 HEK 293 세포를 60~70%의 결합으로, 달베코의 수정된 이글 배지와 10%의 태아 소 세럼이 37도, 이산화탄소 5%로 증가한다.
원하는 고정 시간 최소 3시간 전에 T175 플라스크의 미디어를 30밀리리터의 사전 따뜻하게 된 전체 미디어로 교체하십시오. 분쇄 된 물 얼음으로 가장자리에 아이스 박스를 준비하고 필요한 버퍼, 또한 얼음과 함께 연기 후드에 보관하십시오. 세포를 식히려면 인큐베이터에서 T175 플라스크를 제거하고 얼음에 대해 공식적으로 눌러 최대 표면 접촉을 보장합니다.
화학 연기 후드 안에는 플라스크를 옆으로 기울여 미디어가 세포 반대쪽쪽에서 수집되도록 합니다. 피펫 168 마이크로리터37%의 마이크로리터는 볼륨 포름알데히드에 의해 풀이 된 매체로 직접 계량됩니다. 최종 농도0.2%의 포름알데히드.
즉시 섞습니다. 플라스크를 얼음에 10분 더 배양합니다. 세포 반대의 플라스크 측면을 통해 적절한 폐기물 용기에 미디어를 부어 넣습니다.
칼슘과 마그네슘 이온없이 달베코의 인산염 완충식식염 30 밀리리터에 파이펫을 사용하고 또한 세포 반대쪽에 부드럽게 50 밀리몰러 글리신을 함유하고 있습니다. 플라스크를 흔들어 섞고 플래시를 수평 위치로 되돌리고 얼음에 10 분 더 배양하십시오. 셀 맞은편 플라스크 측을 통해 용액을 붓고 표준 0.25%의 트립신 EDTA 용액 7밀리리터를 부드럽게 추가하여 세포를 분리하고 다시 중단합니다.
실온에서 플라스크를 최대 10분 동안 5분간 배양합니다. 플라스크를 수직으로 찾고 스트리프를 사용하여 플라스크 벽에서 남은 것을 부드럽게 세척하여 분리 된 세포를 수집하고 서스펜션을 얼음에 세팅 된 50 밀리리터 튜브로 옮습니다. 수집된 서스펜션 용액을 20밀리리터의 완전한 미디어로 즉시 보완하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞습니다.
5 분 4 섭씨 동안 100 G에서 튜브를 원심 분리하여 세포를 펠렛. 셀 펠릿은 명확하게 표시되어야 합니다. 미디어를 부어 부드럽게 글리신없이 달베코의 인산염 완충 식염수의 10 밀리리터에 펠릿을 다시 중단합니다.
원심분리기는 5분간 100G로 튜브를 다시 100G로 붓고 4도에서 세척 버퍼를 부어 글리신없이 감산염을 완충한 800 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하지만 마그네슘과 칼슘 이온을 함유하고 있습니다. 다시 중단된 세포를 새로운 저단백질 결합 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 전달합니다. 100G에서 튜브를 섭씨 4도에서 3분간 원심분리합니다.
1 밀리리터 파이퍼를 사용하여 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. 이 단계에서, 세포 펠릿은 영하 80도에서 동결되거나 세포 리시스 단계로 진행할 수 있다. 생물 안전 캐비닛에서 비 이온, 비 데니징 세제 및 아르지나제 억제제 7마이크로리터를 기반으로 300 마이크로리터의 용해 완충제와 1 밀리리터 팁을 사용하여 파이펫팅하여 잘 섞는다.
조심스럽게 1 ~ 3 밀리리터 주사기에 25 게이지 바늘을 부착하고 격렬하게 적어도 일곱 느린 위쪽 섭취량과 빠른 하향 배기 스트로크를 사용하여 혼합물을 파이펫. 주사기와 바늘을 날카로운 쓰레기통에 버리고 31 게이지 바늘과 0.3 밀리리터 주사기로 절차를 반복하십시오. 주사기와 바늘을 날카로운 쓰레기통에 버리십시오.
12, 000 G에서 튜브를 4도에서 5분간 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 새로운 저단백질 결합 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 상피체를 전달합니다. 셀 파편을 모두 저장하고 섭씨 영하 80도에 lysate.
번역 복합체는 버퍼의 이온 조성에 민감합니다. 염화 마그네슘의 생략과 EDTA 첨가물은 높은 침전 특성을 제거했으며, 염화칼슘이 더 나은 결과 피크를 초래하는 동안 개선은 미미했습니다. 따라서 버퍼 하나를 선택했습니다.
2.2%중량의 포름알데히드는 폴리좀을 잘 보존하고, 포름알데히드의 4%중량에 비해 전체 수율을 감소시키지 않았다. 포유류 세포에서, 부피에 의해 0.2%의 무게의 포름알데히드의 훨씬 낮은 농도가 사용되었다. 높은 농도로 상당한 다각형 물질 손실 귀착되었다.
15 밀리머 EDTA는 용액에 첨가되고 모든 후속 버퍼는 고정 된 세포에서 파생 된 다각체 분획에 특유하게 적은 불안정 효과를 나타냈다. 그리고 이 효과는 부분적으로 4%의 고정 된 세포에서 재료로 50 밀리마일러 EDTA로 복제되었으며, 저항하고 더 잘 전개되었습니다. 포도당 고갈은 효모에 가장 극적이고 빠른 번역 억제 효과 중 하나를 유도합니다.
신경 추가 및 국소 원인 조건 유도 다각형 분해 약간 했다, 하지만 분명히 더 많은 폴리좀 낮은 추가 포도 당에서 유지. 중요한 것은, 고정 된 세포에서 다각체 물질은 동적 번역 과정의 차이를 보존하기 위해 포름알데히드 고정의 적합성을 나타내는 굶주린 세포와 비 굶주린 세포 사이의 높은 구별을 보여줍니다. tacy paysake와 같은 접근법에서, 우리가 2 단계 초원심을 고용한 완전한 뿌리 줄기와 잘 정착하지 않는 작은 리보솜 서브 유닛을 제거하는 데 추가적으로 통찰력이 있을 수 있으며, SSU, LSU, RS, RNase 내성 다이아송, DS 및 고차형 다묘의 격리를 허용하여 고정 된 마이크로카피법에 의해 확인됩니다.
고정되지 않은 세포에 비해, 고정 된 세포에서 물질은 가장 빠른 침전 리보소말 분획에서 음순 eIF4A의 높은 존재를 입증했다. eIF4A 타피 스트레인의 고정 물질을 사용하여 자기 IDG 구슬이 함유된 eIF4A의 복합체를 포획하고 농축한 경우, SSU 및 RS의 베타 액틴에 비해 eIF4A의 선택적 농축을 관찰할 수 있었지만, RNase 1번의 분해시 두 번째 그라데이션에서 LSU 분획은 관찰할 수 없었습니다. 다른 번역 휴식 방법에 비해 세포막 전반에 걸친 포름알데히드 작용의 신속성과 교차 링크의 무차별적 특성은 번역 복합 중간체의 최대 다양성보존을 약속합니다.
우리의 연구 결과는 환경 변화 또는 응력 조건에 급속한 세포 반응의 시나리오에서 매우 일시적인 복합체 및 증거의 유용성을 안정화하기 위하여 급속한 포름알데히드 고정의 유용성을 일치합니다.
