Echinococcus granulosus의 스트로빌화 된 형태의 일시적인 거래. 우리는 세 번째 세대 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 Echinococcus granulosus의 다른 발달 단계에서 신속한 일시적인 형질 도입 기술을 설명합니다. 낭포성 echinococcosis 또는 hydatid 질병은 송곳니의 장에 숨어있는 작은 촌충 인 Echinococcus granulosus에 의해 야기 된 가장 중요한 동물 유행성 기생충 질병 중 하나입니다.
병인과 질병 통제 및 예방의 메커니즘을 이해하기 위해 응용 유전 연구가 시급히 필요합니다. 그러나 효과적인 유전자 평가 시스템의 부족은 Echinococcus 종을 포함한 cestode 기생충의 기능적 유전학에 대한 직접적인 해석을 방해합니다. 기생 편평충에서의 유전자 전달의 발전은 원생 동물 기생충과 비교하여 여전히 제한적입니다.
바이러스 전달 시스템의 사용은 지난 이십 년 동안 전이유전자 전달 및 유전자/단백질 조사를 위한 필수적인 도구로 부상했습니다. 그래서 우리는 Echinococcus granulosus의 protoscoleces 및 strobilated 웜에 대한 GFP 리포터 유전자의 렌티바이러스 일시적 형질도입을 평가하였다. 도 1은 Echinococcus granulosus 단계에 대한 연구 프로토콜의 개략적인 프리젠테이션을 보여준다.
하나, hydatid 낭종을 수집. 도축장에서 일상적으로 도살되는 자연적으로 감염된 양으로부터 간 수다이드 낭종을 수집하십시오. protoscoleces를 흡입하기 전에 멸균 거즈와 70 % 알코올을 사용하여 낭종 표면을 완전히 살균하십시오.
흡인물 20 내지 50 mL의 히다티드 유체를 멸균 50 mL 코니컬 튜브로 배출한다. 배수 후, 날카로운 칼날로 낭종을 닦아내고, 발아층을 멸균 된 50 mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 짧은 기간 동안 흔들어 프로토스콜렉스 수집을 증가시킵니다. 프로토스콜렉시를 PBS 완충액으로 세 번 내지 다섯 번 세척한다.
5분 동안 0.1%eosin의 프로토스콜렉시를 관찰하여 광현미경으로 프로토스콜렉세스의 생존력을 결정하였다. 배양을 위해 적어도 95 %의 생존 가능성을 가진 protoscolece를 사용하십시오. 프로토스코렉스 침전물을 2mL의 펩신으로 15 내지 20분 동안 처리한다.
개별 프로토스콜렉시를 분리하기 위해, 프로토스콜렉세스 퇴적물을 PBS에 재현탁시키고 멸균 거즈의 두 층을 통과시켜 새로운 멸균 50 mL 원뿔형 튜브로 통과시킨다. 둘째, 성인 벌레를 얻기 위해 Echinococcus granulosus의 protoscolece의 biphasic 재배. 액상 배지 10 mL를 각 25 센티미터 정사각형 배양 플라스크에 첨가한다.
약 5,000개의 프로토스콜렉을 배양 플라스크에 넣고 CO2 인큐베이터로 옮깁니다. 24 내지 48시간 후, 프로토스코클레스를 고체상을 갖는 새로운 플라스크로 옮기고 플라스크 당 동일한 신선한 액상 배지 한 mL를 첨가한다. 플라스크를 인큐베이터, 섭씨 37도, 5 % CO2로 옮깁니다.
다섯 일에서 칠일마다 배지를 신선한 액상 매질로 교체하십시오. 셋째, Echinococcus granulosus의 protoscoleces의 단식 재배. 단식 재배가 형질도입 24 ~ 48 시간 전에 이루어 지도록하십시오.
RPMI 및 10%FBS로 25센티미터 제곱 배양 플라스크에서 약 5,000개의 프로토스콜렉을 배양한다. 사용할 때까지 플라스크를 CO2 인큐베이터로 옮기십시오. 넷째, 바이러스 생산 및 준비를 위한 세포 배양.
500, 000 HEK 세포를 10%FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 마이크로그램/mL 스트렙토마이신이 있는 DMEM 5mL가 들어있는 25센티미터 제곱 플라스크에 옮깁니다. HEK2 세포를 섭씨 37도에서 5%CO2로 배양하고 48시간마다 완전한 배지에 계대시킨다. 마지막으로 형질도입을 위해 저역 HEK 세포를 사용한다.
다섯, 세 번째 세대 렌티바이러스 벡터를 사용한 바이러스의 생산 및 제조. 첫째 날, HEK 세포를 6-웰 배양 플레이트에서 트립신화한 후, 웰 당 70, 000 세포를 10%FBS를 함유하는 신선한 항생제 무함유 DMEM으로 시드한다. 인산칼슘 방법에 의한 형질도입을 위해 50 내지 60%의 플루언시에서 세포를 사용한다.
둘째 날, 실험 2 내지 세 시간 전에 세포 배양 배지를 2%FBS를 함유하는 신선한 항생제 무함유 DMEM으로 교체한다. 1.5mL 튜브에서 7마이크로그램/마이크로리터 pCDH513b 전달 벡터, 4마이크로그램/마이크로리터 PLPII, 4마이크로그램/마이크로리터 PLPI 및 2 마이크로그램/마이크로리터 PMD2G 헬퍼 벡터를 포함한 3세대 렌티바이러스 플라스미드를 혼합합니다. HEPES 버퍼를 혼합물에 첨가하여 422 마이크로 리터의 부피에 도달하십시오.
16 마이크로리터의 1%TE 완충액을 혼합물에 첨가한다. 튜브에 62 마이크로 리터의 2.5 mL 염화칼슘을 넣고 잘 섞으십시오. 혼합물에 500 마이크로리터의 2x HBS 버퍼를 첨가하고, 파스퇴르 피펫을 사용하여 1 내지 2분 이내에 드롭하여 드롭한다.
반불투명 용액이 얻어질 때까지 부드럽게 혼합하고 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다. 마지막에 혼합물을 각 접시에 천천히 넣고 느린 원형 동작으로 분배하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 5%CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 4~6시간 후에 배지를 10%FBS를 함유하는 항생제가 없는 DMEM으로 교체한다.
셋째 날, 거꾸로 된 형광 현미경을 사용하여 성공적인 일시적 형질도입 및 세포 생존율을 확인한다. 넷째 날, 각 웰의 상등액을 수집하여 배양액으로부터 바이러스를 수확하고 사용할 때까지 음수 70°C에 보관한다. 여섯, 바이러스와 함께 Echinococcus granulosus의 다른 단계의 일시적인 형질도입.
첫째 날, 유전자 전달을 위해 12-웰 배양 플레이트를 사용한다. 5, 000 내지 50, 000 HEK 세포를 내부 기준으로서 완전한 DMEM 배지와 함께 삼중으로 배양한다. RPMI와 10 % FBS에서 세 배로 150 개의 신선한 프로토스콜렉을 배양하십시오.
30마리의 스트로빌화된 웜을 삼중으로 배양하여 DMEM 및 10% 열 불활성화 FBS로 배양한다. HEK 세포와 웜의 여러 단계를 형질감염시키기 위해 네 마이크로그램/mL 형질감염 시약과 함께 1백만 개의 바이러스를 혼합하여 준비하십시오. 혼합물을 각 접시에 천천히 넣고 느린 원형 동작으로 분배하십시오.
플레이트를 섭씨 37도, 5%CO2의 CO2 인큐베이터에서 네 시간에서 여섯 시간 동안 배양합니다. 형질감염 시약의 독성 영향을 최소화하기 위해 각 샘플의 배지를 동일한 완전한 배양 배지로 교체하십시오. 둘째 날, HEK 세포, 프로토스콜렉시스 및 스트로빌화된 웜에 대한 일시적 형질도입의 효율을 증가시키기 위해 이전의 두 단계를 반복한다.
모든 플레이트를 세포 배지의 유형에 따라 동일한 배양 조건으로 CO2 인큐베이터에서 24 내지 48시간 동안 인큐베이션한다. 셋째 날, 형광 현미경을 사용하여 형질도입이 성공적인지 확인하십시오. 대표적인 결과.
여기서 우리는 세 번째 세대 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 Echinococcus granulosus에서 신속하고 효율적인 일시적인 형질 도입 기술을 설명합니다. 우리는 이전 연구에 따라 스트로빌 화 된 웜을 얻기 위해 biphasic 배양 배지에서 protoscolece를 배양했습니다. Protoscolece는 여섯 주간의 체외 배양 후에 스트로빌화 된 웜으로 개발됩니다.
Echinococcus granulosus의 상이한 단계는 질내 프로토스콜렉스를 포함하는 이phasic 배양 배지에서 관찰되었고, 도 2A, 질내 프로토스콜렉세스, 도 2B, 및 첫 번째 및 세 번째 프로글로티드 형성을 갖는 스트로빌화된 웜, 도 2C를 통해 E.Protoscoleces 및 단식 및 이phasic 배양으로부터 수득된 스트로빌화된 웜을 각각 GFP 발현 렌티바이러스에 의해 형질감염시키고, 도 3. HEK 세포는 GFP를 일시적 형질도입 과정 대조군으로서 명확하게 발현시켰다. 성인 웜은 tegumental 층에서 GFP를 가장 뚜렷하게 표현했습니다.
그러나, 프로토스콜렉세스는 48시간 후에 GFP 발현의 다소 낮은 수준을 입증하였다. 프로토스콜렉체 주위의 일부 낭포 유체 잔기 및 또는 발아층 파편은 형질감염된 샘플에서 일부 형광 배경을 야기하였다. HEK 세포 및 스트로빌화 된 웜에서 형광의 강도는 24 및 48 시간 후에 증가했습니다.
선충류와 Platyhelminthes 생물학의 분자 기초를 이해하는 것은 동물 유행성 기생충의 병원성에서 가장 중요한 국경 중 하나입니다. 효과적인 유전자 평가 시스템의 부족은 Echinococcus 종을 포함한 cestode 기생충의 기능적 유전학을 직접 해석하는 데 주요 장애물입니다. 이 연구의 주요 목표는 미래의 Echinococcosis 연구에서 중요 할 렌티 바이러스 벡터 형질 도입 과정을 설명하는 것이 었습니다.
결과는 스트로빌화 된 웜이 프로토스콜렉시보다 유전자의 일시적인 형질도입에 더 잘 반응한다는 것을 보여 주며, 이는 스트로빌 화 된 형태의 광범위한 tegumental 구조의 결과 일 수 있습니다. 그러나, 렌티바이러스 형질도입의 특성으로 인해, 다세포 프로토스콜렉 및 스트로빌화된 웜에서의 형광 강도는 전형적으로 단층 HEK 세포보다 훨씬 낮다. Echinococcus에 대한 게놈 및 전사체 수준뿐만 아니라 다양한 기생 및 자유 생활 편평충 모델 시스템에서 응용 유전 연구가 시급히 필요합니다.
따라서, 촌충에 대한 유전자 전달 공정의 개발은 바이러스 기반 유전자 맵핑 또는 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집과 같은 새로운 기술의 잠재적 사용을 위한 길을 열어준다. 이 연구는 촌충 모델에서 렌티 바이러스 형질 도입을 제시하고 편평 웜 생물학에 잠재적 인 함의가있는 유망한 결과를 보여줍니다. 그러나 방법을 개선하고 향후 실험을위한 이러한 기술의 적용 가능성을 개발하기 위해서는 더 심층적 인 연구가 필요합니다.
