아이메리아 종에 대한 경질 프로토콜의 설립은 유전자 기능의 연구를 진행하는 데 도움이 될 것입니다, 새로운 백신을 개발, 아이메리아에 대한 새로운 약물 목표를 선별. 이 기술을 사용하여, 우리는 Eimeria의 몇몇 종의 전염을 달성하고, 핵은 eimerian 기생충에 있는 유전 조작의 적용을 용이하게 하기 위하여 유용한 공구입니다. Eimeria의 핵은 시험관에서 배양될 수 없는 그밖 기생충의 transfection를 위한 참조를 제공하고 그들의 유전 조작의 연구를 가속화할 것입니다.
이 기술을 처음으로 시도하면 실험 중에 스크램블을 피하기 위해 트랜스펙트 시작 전에 모든 시약과 악기를 잘 준비해야합니다. 이 방법의 실현은 이 실험의 복잡한 세부 사항을 볼 수있는 Eimeria의 트랜스포메이션에 집중하는 사람들을 돕는다. 스포로시스트의 방출로 시작하려면, 원심분리기는 칼륨 이드로메이트 용액의 7개의 포자화 난모세포에 1회 10회, 5분 동안 300배.
PBS로 세 번 씻으시면 됩니다. PBS의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 혼합물을 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 1mm 직경의 유리 구슬의 동일한 볼륨을 추가하고, 스포로시스트를 방출하기 위해 소용돌이 믹서를 사용하여 난모성 서스펜션을 진동.
매 분마다 현미경 검사법에 의한 스포로시스트의 방출을 모니터링합니다. 난모종의 90% 이상이 파손되면 소용돌이를 멈추십시오. 스포로시스트 서스펜션을 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 1, 600배 g로 옮긴다.
침전을 50% 밀도 그라데이션 용액1밀리리터로 재일시 중단하고 원심분리기는 1분 동안 10, 000배 g로 재주합니다. 스포로조이트를 방출하려면 침전물을 침전 버퍼로 재중단하고 42도의 섭씨 수조에서 40~60분 동안 배양하여 산포로조이트방출한다. 퇴출 시 5분마다 한 번씩 튜브를 흔들어 줍니다.
산포로조이트 중 90% 이상이 방출되면 인큐베이팅을 중단하십시오. 원심 분리기는 600배 g에서 10분 동안. 55% 밀도 그라데이션 용액의 1밀리리터로 침전을 다시 중단하고 1분 동안 10, 000배 g에서 튜브를 원심분리합니다.
PBS의 1 밀리리터로 강수량을 다시 중단하고 혈우세포계를 사용하여 스포로조이트수를 계산합니다. 아이메리아 괴사트릭스의 2세대 메로조이트를 수집하려면 노른자 줄기에서 일레오세칼 오리피스까지 닭장 내 장수를 세로로 자르고, 페트리 접시에 PBS 또는 HBSS로 부드럽게 세 번 씻으십시오. 내장을 조각으로 자르고 소화 버퍼가 있는 원추형 플라스크에 넣습니다.
플라스크를 37°C의 마그네틱 믹서에 넣고 30~60분간 교반바를 사용하여 메로조이트를 방출합니다. 인큐베이션 30분 후, 5분마다 현미경 검사를 통해 메로조이트 방출을 모니터링합니다. 메로조이트정화를 위해 소화된 메로조이트(merozoites)를 4겹에 걸쳐 붓고 50밀리리터 튜브로 걸러내고, 10분 동안 600배 g의 원심분리를 한다.
원심 분리 후 장 잔해가 들어있는 상체를 폐기하십시오. 정제된 메로조이트로 강수량을 1.5밀리리터 튜브로 옮기. PBS의 1 밀리리터로 강수량을 다시 중단하고 혈류계를 사용하여 메로조이트수를 계산합니다.
먼저, 10분 동안 600배 g에서 산포로조이트 또는 메로조이트 서스펜션원심분리를 합니다. 그런 다음 상체를 폐기하십시오. 다음 순서로, 핵 형질 완충제 85 마이크로 리터, 플라스미드 10 마이크로 그램, 및 25 단위의 제한 효소를 스포로조이트 또는 메로조이트함유 1.5 밀리리터 튜브에 추가합니다.
서스펜션을 핵 트랜스펙트 컵으로 옮기. 컵을 핵 전달 홈에 넣습니다. 전원 버튼을 사용하여 핵성형 장치를 켜고, 형질 전환 절차 U-033을 선택한다.
프로그램이 끝나면 핵형성 장치의 X 버튼을 누르면 화면이 OK를 표시하여 핵포션이 성공했음을 나타냅니다. 0.5를 덜벡코의 수정된 이글 의 매체에 넣고 핵을 제거하여 반응을 멈춥시다. 부드럽게 혼합 한 후 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오.
뉴클레오감염 기생충을 7일 된 닭으로 접종한다. 에이메리아 괴사트릭스 또는 에이메리아 테넬라의 스포로조이트의 메로조이트는 클로아컬 루트를 통해 접종하지만 정맥 주사를 통해 에이메리아 아세르불리나 스포로조이트에 접종한다. 대변에서 난모세포를 수집한 후, 형광 활성 세포 분류및 1킬로그램 피리메타민당 150 밀리그램을 사용하여 형질 전환 인구 비율을 증가시킵니다.
이 프로토콜은 eimerian 기생충을 transfect에 사용되었습니다. 이 연구에서는 밀도 그라데이션 솔루션을 사용한 후 Eimeria 테넬라의 스포로시스트 및 스포로요이트뿐만 아니라 Eimeria 테넬라의 스포로시스트 및 스포로조이트뿐만 아니라 2세대 메론트와 메로조이트가 여기에 표시됩니다. 뉴클레오감염 된 메로조이트와 뉴클레오 감염 스포로조이트에 감염된 후 에이메리아 테넬라의 난모세포에 감염된 후 아이메리아 괴사의 난모의 이미지는 성공적인 뉴클레오션을 나타낸다.
이 절차를 시도하는 동안 가장 중요한 것은 스포로조이트와 메로조이트의 정제가 성공하고 스포로시스트와 스포로조이트는 더 정제되도록하면서 OS2를 제거하기 위해 50 % 밀도 그라데이션 솔루션을 사용하는 것입니다. 이 절차에 따라, 당신은 미래에 Eimeria 기생충의 트랜스퍼링을 단순화하기 위해 난모세포 또는 스포로시스트를 위장과 같은이 프로토콜을 최적화 할 수 있습니다. 아이메리아에서 의 형질 전환의 발달과 함께, 아이메리아의 CRISPR-Cas9 기술은 Eimeria의 신중한 유전자 조작을 크게 제시하고 적합한 백신 전달 수단으로 적용 될 것으로 예상될 것입니다.
