단백질 단백질 상호 작용의 연구 결과는 많은 생물학 프로세스의 규칙의 이해를 제공합니다. 여기서 우리는 Y 존 신발 및 공동에 의해 초기 설명 절차를 보여줍니다. 2007년 저자들이 FRET와 함께 BiFC를 사용하여 3개의 단백질 분자 간의 삼자 상호 작용을 검증한 근로자.
그러나 FRET 측정을 입증하기 위해 이 절차에형형수명 측정을 포함시켰습니다. 삼자 상호 작용을 보여주기 위해, 우리는 단백질을 선택했습니다, 이는 호모메로 알려져 있습니다. 더욱이, 그것은 또한 이 프로토콜에 있는 C 단백질이라고 칭한 단백질의 칼슘 센서와 상호 작용하기 위하여 사내에서 검증되었습니다.
MNC 단백질은 세포질에서 상호 작용합니다. 이 기술에서, 2개의 단백질은 분할YFP 단백질로 태그됩니다. 그들의 상호 작용은 FRET 기증자 역할을 하는 CFP와 태그되는 세 번째 상호 작용 파트너에 FRET 수락자 역할을 하는 기능적인 YFP의 배상을 초래합니다.
PCR에 의해 우리의 경우에 M 및 C 유전자인 관심 있는 유전자의 코딩 서열의 증폭으로 시작하고 적당한 진입 벡터에서 복제합니다. 제한 다이제스트 및 DNA 염기서열에 의해 플레이트를 포함하는 항생제에 선택되는 클론을 검증합니다. 재구성된 CDS'를 엔트리 클론에서 대상 벡터로 동원합니다.
이 실험에 사용된 모든 벡터는 표 하나에 나열됩니다. 마지막으로, 전공에 의한 대상 벡터로 농균 GV3101 세포를 변환한다. 여기에서 우리는 니코티아나 벤타미안식물을 재배하고 있으며, 여전히 4~6개의 식물이 성장하는 챔버에서 통제된 조건에서 단계를 남깁니다.
토양, 코코 토탄 및 퇴비를 2:1:1의 비율로 혼합하여 토양 믹스를 준비합니다. 이 믹스의 1 인치 두께층을 플라스틱 트레이에 펴서 토양 침대를 만들고 약간의 물로 포화시니다. 토양 위에 약 200개의 씨앗을 뿌리고 서 있는 물의 약 1센티미터 정도더 큰 트레이로 옮겨보세요.
이 트레이를 플라스틱 랩으로 덮어 수분 챔버를 만듭니다. 이 트레이를 16시간 빛과 8시간 의 어두운 주기로 섭씨 23도로 설정된 성장 챔버로 옮기습니다. 2 주 후 물 포화 토양 믹스를 포함하는 작은 3 ~ 4 인치 냄비에 젊은 묘목을 전송합니다.
이 냄비를 플라스틱 트레이에 놓고 4 주 동안 챔버를 성장시키기 위해 옮기십시오. 농구침의 경우, 세균균은 적절한 비율로 농균의 P19 균주와 함께 신선하게 하위 배양되고 혼합되어야 합니다. 10ml의 줄무늬 플레이트에서 BiFC 및 FRET 구조를 포함하는 GV3101 농균 균주를 접종하여이 절차를 시작합니다.
적절한 항생제를 함유하는 국물에. 함께, 또한 농균의 P19 균주의 문화를 시작, 이는 유전자 침묵을 방지하기 위해 추가됩니다. 플라스크를 알루미늄 호일로 덮고 인큐베이터 셰이커에 보관하고 16시간 동안 170 RPM에서 섭씨 28도 설정합니다.
야간 성장 후 1 ml.는 분광광계를 이용하여 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하기 위해 일회용 큐빗으로 이들 배양의 1ml를 전송한다. 최종 OD가 0.5이고 P19의 배양은 2ml의 총 부피에서 0.3이 되도록 균주를 포함하는 적절한 BiFC 및 FRET 파트너의 배양을 혼합한다.
이러한 비율을 달성하기 위해 이러한 계산에 대해 화면에 표시된 수식을 따릅니다. 3000G에서 혼합 된 아그로 박테리움 배양을 실온에서 5 분 동안 원심 분리하고 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. 2 ml에 펠릿을 일시 중단합니다.
침투 버퍼. 당신은 완전히 균질 세포 현탁액에서 세포를 다시 중단 소용돌이 믹서를 사용해야 할 수 있습니다. 이 후 3 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 튜브를 배양.
한편, 각 식물 냄비에 물입될 구조 혼합물에 라벨을 부착합니다. 농균 혼합물로 바늘없는 주사기 1 ml를 채웁니다.
주사기 끝을 완전히 확장된 잎의 축축측으로 부드럽게 누르고 다른 쪽에서 잎을 지지합니다. 주사기 팁의 2~3배에 해당하는 리프 영역에 용액이 채워날 때까지 플런저를 부드럽게 밀어넣습니다. 한 잎에 최대 4개의 반점에 세균 믹스에 침투하고 침투의 한 종류에 대한 3 ~ 4 잎이 절차를 반복.
또한 침투를 위해 구조당 적어도 두 개의 식물을 포함한다. 70%의 알코올로 손을 닦거나 장갑을 교체하여 교차 오염을 방지해야 합니다. 모든 냄비를 트레이로 옮기고 동일한 성장 조건에서 성장 챔버에서 배양하십시오.
형광 현미경을 사용하여 농구침 잎의 작은 부분을 확인하십시오. 세포에서 YFP와 CFP 모두에서 형광이 검출되면 BiFC FRET-FLIM 분석기의 공초점 현미경으로 진행된다. 우리의 경우에, 이 분석은 농약 침투 후에 3 일 실행되었습니다.
이제 식물은 주사기 팁 상처에서 5 ~8mm에서 현미경 절단 사각형 잎 샘플에서 시각화 할 준비가되어 증류수에 장착할 수 있습니다. 깨끗한 커버 슬립을 위에 놓고 밀봉합니다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 이러한 샘플을 시각화합니다. 이 절차에서, 두 단백질 간의 상호 작용을 결정하고 정량화하는 기초는 FRET의 효율성을 계산하는 데 사용되는 수용자와의 상호 작용에 따라 FRET 기증자 파트너의 형광 수명 감소입니다. 이 경우 FRET 수용자가 단일 분자가 아니므로 삼자 상호 작용의 복잡성이 더욱 증가하지만, 먼저 기능적인 FRET 수용자 형광이 되기 위해 생체 내에서 재구성되어야 하는 분할 YFP BiFC 쌍이 된다.
FRET-FLIM을 수행하기 위해, 우리는 기증자 분자 형광 수명을 결정해야합니다, 먼저 혼자 다음 FRET 파트너의 존재. 공초점 레이저 스캐닝 현미경에서 FLIM 응용 프로그램을 열고 콘솔을 시작하고 패턴 인식 광자 계수를 사용하여 형광 수명을 측정합니다. 표준 모든 광자 계수 측정 모드를 선택합니다.
우리는 농구침 식물의 두 가지 유형을 취할 것입니다. CFP 유전자를 가지고 있고 다른 하나는 MYFP와 함께 CCFP를 가지고 있기 때문에 M 단백질의 상호 작용은 이미 BiFC 및 Y2H를 사용하여 C 단백질로 검증되었기 때문에, 우리는 이 상호 작용 쌍과 좋은 FRET 효율을 기대합니다. 이제 우리는 먼저 CCFP 농약 잎을 스캔하고 좋은 CFP 형광을 보여주는 세포를 찾습니다.
현미경 설정이 화면에 표시됩니다. 샘플은 펄스 당 약 0.1 광자를 달성하기에 충분한 레이저 전력으로 조명된다. 가변 형광 강도를 가진 샘플의 경우 50 프레임을 캡처하여 수명 측정에 필요한 적절한 광자를 수집합니다.
CFP는 확인 적응으로 인해 두 개의 형광 수명을 나타내는 것으로 알려져 있으므로 N값을 2와 동일하게 유지하면서 지수 재수렴 모델을 사용하여 데이터를 공급합니다. 이러한 설정에서는 두 수명이 1및 3.2 나노초에 표시됩니다. 우리는 모든 후속 계산에 대한 더 높은 수명을 사용합니다.
이제 CCFP와 MYFP 간에 FRET를 측정하도록 설정되어 있습니다. 이를 위해 CCFP 및 MYFP를 사용하여 농가 침투 식물의 잎 샘플을 사용해 보겠습니다. 우리는 CCFP와 MYFP를 모두 표현하는 세포를 찾고 전체 40 나노 미터 펄스 레이저와 514 나노 미터 백색 광 레이저를 사용하여 흥미 진진한 하여 각각의 방출 패턴을 확인합니다.
그 후 FLIM 콘솔로 전환하여 CCFP의 수명을 측정하기 위해 이전에 사용한 것과 동일한 설정을 사용하여 CFP의 수명을 측정합니다. 그러나 이번에는 셀이 CCFP와 잠재적으로 상호 작용하고 CCFP의 수명 감소를 일으킬 수있는 MYFP를 표현하고 있습니다. N지수재컨볼루션 모델을 사용하여 얻은 그래프를 2와 동일하게 읽으면서 실제로 CFP 수명이 3.2에서 2.6나노초로 감소합니다.
이제 소프트웨어에서 FRET 콘솔을 시작하고 소프트웨어에 제공된 방정식에서 의심할 여지 없는 수명을 수동으로 입력하여 FRET 효율을 계산하고 관찰된 FRET 효율은 56%로 최종 단계로 이동하여 세 파트너 간의 상호 작용을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 CCFP 및 MYFPN과 MYFPC와 공동 침투한 식물의 리프 샘플을 MYFPC와 함께 채취합니다. 우리는 두 M 단백질 사이의 상호 작용에서 발산 되는 CFP와 재구성된 YFP 형광을 모두 보여주는 세포를 위해 잎 식물을 검사합니다.
우리는 이전에 사용 했던 것과 동일한 레이저 와 방출 파장을 사용 합니다. 그 후, 우리는 514 나노 미터 레이저를 끄고 FLIM 콘솔로 이동합니다. MYFP 이머가 CCFP와 상호 작용하는 경우.
우리는 MYFP와의 상호 작용 중에 관찰된 CCFP의 수명 감소를 보아야 합니다. 그러나 CCFP가 MYFP 이머와 상호 작용하지 못하면 형광 수명은 3.2 나노초에서 계속 볼 수 있어야 합니다. 위에서 언급한 것과 유사한 설정을 사용하여 재구성된 YFP가 있는 경우 CFP 수명을 측정합니다.
N 지수 재수렴 모델을 사용하여 그래프에 2개와 동일한 그래프를 장착하고 FRET 콘솔로 이동합니다. 그리고 네 CFP 수명은 3.2에서 2.3 나노초로 감소합니다. 우리는 위에서 설명한 대로 FRET 효율을 계산합니다.
계산된 FRET 효율은 55%이며, FRET 승인기의 존재와 부재에서 FRET 기증자 파트너의 형광 수명을 측정하기 위해 FLIM을 사용했습니다. 기증자의 형광 수명 감소는 두 단백질 사이의 긍정적 인 상호 작용이 있다면 예상되었다. 긍정적 인 제어의 경우, 즉 CCFP및 MYFP입니다.
우리는 기증자의 형광 수명이 3.3에서 2.5 나노초로 감소하고 FRET 효율은 56%로 두 개의 단백과 C 단백질 사이의 상호 작용에서 비롯된 재구성된 YFP와 유사한 운동이었으며, 또한 기증자의 형광 수명이 2.6나노초로 감소하는 결과를 초래하였다. 계산된 FRET 효율은 이 경우 약 55%였습니다. FRET 기증자의 형광 수명 감소는 이 단백질 사이 삼자 상호 작용을 위한 강력한 증거를 제공합니다.
여기에서 기술된 프로토콜은 살아있는 세포에 있는 삼자 단백질 단백질 상호 작용을 결정하는 강력한 공구입니다. 이 절차는 또한 어떤 단백질 복합체의 기능 및 생리적 중요성을 해독에 중요한 결과 복합체의 세포 내 국소화를 결정하는 것을 도울 수 있습니다. 결론적으로, BiFC 기반 FRET-FLIM 분석법은 삼자 단백질 상호 작용의 중요한 측면을 연구하고 특성화 할 수있는 기회를 제공하며, 이는 동물 및 식물 시스템 모두에서 단백질 단백질 상호 작용 연구에 도움이 될 수 있습니다.
