저자는 폐쇄 시스템 지식, 가방 디자인, 가방 실러스 및 용접의 대출뿐만 아니라 HYPERStack의 회로도에 가방을 만드는 그들의 도움을 Lonza 워커스빌 감사하고 싶습니다.

1. HYPERStack 용기 - 가스 투과 재료 기술 배경 <ol><li> HYPERStack 우주선은 세포의 대사에 대한 76.2micron 가스 침투성 폴리머 필름을 통해 가스 교환에 의존 세포의 폐쇄 시스템 culturing위한 multilayered 함선입니다. </li><li> HYPERStack 선박은 선박 내부의 세포 위에 &quot;헤드 스페이스&quot;를하지 않는 더 많은 전통적인 세포 배양 용기에서 다릅니다. 오히려 선박 내의 가스 교환이 &quot;상부&quot;를 포함하는보다, 가스 투과 제품은 대기 개방 각 문화 챔버 아래에 공기 공간 ( &quot;tracheal&quot;공백으로 함)합니다. </li><li> 이 tracheal 공간 상응하는 가스 교환을하기 위해 선박의 각 세포 배양 구획에 성장 세포 수 있습니다. </li><li> 가스 투과 필름은 멸균 환경을 유지하면서 가스 교환이 발생할 수 있습니다. 여러 레이어의 각각에 대해 모든 유체 조작은 단일 입력 포트를 통해 발생합니다. </li></ol> 2. HYPERStack 선박 구성 요소 요약 <ol><li> Stackette는 상단 플레이트 및 가스 투과 필름으로 구성되어 있습니다 각각의 세포 배양 구획이다. 세포는이 구역 내에 양식입니다. </li><li> 액체 매니폴드는 HYPERStack 모듈 내에서 함께 12 stackette 레이어 각각 연결합니다. 모듈 12 레이어의 배수에서 혈관 형성 튜브와 연결됩니다. 매니폴드는 사용자가 전체 선박 한 유체 조작을 할 수 있습니다. </li><li> 에어 매니폴드도 함께 stackette 레이어를 연결하지만 유체 추가가 발생할 때 혈관에서 공기를 치환하는 데 사용됩니다. 그것은 충전하는 동안 사용할 수있는 입력 줄이 포함되어 있습니다. </li><li> Tracheal 공간 가스 교환은 각 레이어 &#39;가스 투과 필름을 통해 발생할 수 있도록, 각 stackette 레이어 사이의 야외 공간입니다. </li><li> 액체 처리 튜브는 액체 연료에 연결된 모든 폐쇄 시스템 유체 조작을하는 데 사용됩니다. 이 구성 요소는 사용자 정의할 수 있습니다. </li><li> 벤트 튜브는 공기 매니폴드에 연결된 공기 필터를 포함하고 불임을 유지하면서 과잉 공기를 공개하는 데 사용됩니다. </li><li> 체이스 튜브는 필터와 클램프를 가지고 있으며 액체 처리 튜브에 연결되어 있으며, 혈관을 기입 후 액체 처리 튜브에서 유체 대피하는 데 사용됩니다. </li><li> 코닝 스택 조작하는 사람 또는 CSM 사용시 올바른 위치에있는 혈관을 배치 지원하는 처리 장치입니다. </li><li> 필링 웨지는 스테인레스 스틸 수동 HYPERStack 혈관을 작성 때 사용 지원됩니다. </li></ol> 3. HYPERStack 선박에서 사용되는 가스 투과 필름을 통해 가스 확산 결과 <ol><li> 통풍 헤드 스페이스 전통적인 세포의 성장 시스템에서 미디어에있는 산소는 문화 3 일 50 % 이상의 평균 소진됩니다. (그림 1) </li><li> 같은 세포 성장 시스템에서 미디어의 3mm 높이의 산소 기울기는 셀 계층에서보다 상부 접합에 언론에 거의 50% 큽니다. (그림 2) </li><li> 76.2micron 가스 투과 폴리스티렌 필름을 통해 산소의 확산은 미디어의 2.6mm 통해 확산 같습니다. HYPERStack 선박에 사용되는 가스 투과 필름은 가스 교환이 셀 계층에서 발생 할 수 있습니다. </li><li> 세포 합류로 성장할로 HYPERStack 선박의 tracheal 공간에 산소의 %는 상수이다. (그림 3) </li></ol> 4. 미디어 가방 준비 <ol><li> HYPERStack - 12 계층 우주선 미디어 1.3L 소요되며 HYPERStack - 36 계층 우주선 미디어 3.9L 걸립니다. </li><li> 전에 체포 미디어를 inoculating하는 혈청은 사용할 수있다면, 튜브는 미디어 가방에 혈청 가방 용접 철저히 섞는다. </li><li> 큰 가방의 클램프를 사용하여 봉투에 미디어의 약 300 ML를 고정. 이것은 모든 주사 세포 입력하고 아무도 미디어 가방에 남아 없습니다 중에 사용되도록합니다. 가방 스탠드에 플레이스 미디어 가방. </li></ol> 5. Inoculating 미디어 <ol><li> 세포 현탁액와 연결된 튜브와 주사기를 입력합니다. 미디어 가방에 세포 현탁액을 포함하는 주사기에서 튜브 용접 3 / 16 &quot;튜브. </li><li> 미디어 가방에 세포 현탁액을 주사 잘 섞는다. </li></ol> 6. 프로 시저 작성 <ol><li> 튜브는 HYPERStack 우주선의 3 / 8 &quot;액체 취급 튜브. (연결 무균 또는 다목적 (MPCs) 연결을 사용하여, 당신이 또한 선박에 미디어 가방을 연결할 수)에 주사 미디어 가방 용접. </li><li> HYPERStack에 액체 처리 및 추적 튜브에 클램프를 닫습니다. </li><li> 후크 환기 필터 튜브 CSM에있는 지주 클램프로, 부하 위치에 CSM에 HYPERStack 36 레이어 선박 놓으십시오. 뚜껑을 조여하여 입력 위치로 CSM 이동합니다. 정확한 입력 위치로 혈관을 넣어, 공기 필터는 채우기 작업 중에 젖음 방지를 위해 최상의 위치에 지금있다. 10 ° 각도 허용 equilibr작성 중에 레이어에 액체 에이션. 작성 쐐기에 미치는 측면에 배치 HYPERStack - 12 계층 우주선이 작성을위한 올바른 위치에 있습니다. </li><li> HYPERStack 우주선 (높은 아님)과 같은 수준에서 가방을 위치하여 입력 라인에서 맑은 공기. 추적 튜브 클램프가 닫힌 상​​태로 유지하고, 혈관을 입력 유체 수 있도록 액체 처리 튜브 클램프 및 미디어 가방 클램프를 엽니다. </li><li> 가방 스탠드를 사용하여 선박에 세포 현탁액의 흐름을 돕기 위해 미디어 가방을 올립니다. </li><li> 주사 미디어의 모든 혈관을 입력 때까지 용기를 채우, 미디어의 300 ML은 여전히​​ 미디어 가방의 상단 부분에 유지됩니다. 혈관을 작성 계속 미디어 가방에서 클램프를 제거합니다. 액체는 상부 공기 매니폴드를 접근으로 작성을 통해 방지하기 위해 미디어 가방을 낮추는 방법으로 채우기 속도를 느리게. 천천히 채워 줄 수있는 액체 레벨을 가지고 있으며 액체 처리 튜빙을 클램프. </li></ol> 7. 레이어로 액체를 잠글 수 절연 절차 <ol><li> manifolds 두 세트가 가장 높은 위치에 있으므로 절연 위치로 CSM에 HYPERStack 선박을 지참하고 선박의 높이 아래 미디어 가방을 낮추십시오. HYPERStack - 12 레이어 선박은 선박의 측면에 손을 넣어하고 충전 쐐기를 리프트에 다른 사용하여 격리 위치로 해제하실 수 있습니다. </li><li> 직립 자세에서 열린 체이스 필터, 더 체이스 튜브 클램프를 엽니다. 이것은 미디어 가방에 다시 액체 처리 튜브 미디어를 비어 있거나 추적합니다. 튜브가 비어되면, 미디어 가방 튜빙의 클램프를 닫습니다. </li><li> 수직 위치에 추적 튜브 필터를 유지, 남은 액체는 용기에 입력하고 평형 수 있도록 HYPERStack에있는 액체 처리 튜브에 클램프를 엽니다. 이 발생 1-2 분 동안 기다리십시오. </li><li> manifolds이 왼쪽에 있도록 CSM에 HYPERStack 선박을 돌립니다. CSM의 부하 위치로 함선을 낮춥니다. 왼쪽으로 약간 HYPEStack - 12 레이어 혈관을 로킹하면 충전 쐐기의 제거를 허용합니다. 추적 및 액체 처리 튜브 모두에​​서 클램프를 닫습니다. </li><li> 미디어 가방 이제 선박에서 제거되었거나 그것은 나중에 수확 절차에 사용하기 위해 첨부된 남아있을 수 있습니다. 첨부된 미디어 가방을 저장하려면 HYPERStack 선박의 저장 트레이에 유지 밴드 아래 빈 가방과 가방에 남아있는 미디어 및 장소 롤. </li><li> 인큐베이터에 HYPERStack 용기를 이동합니다. 선박 관리를 나르는 때 공기 필터를 입력부터 액체 유지로 이동해야합니다. 이것은 약간 위쪽으로 HYPERStack의 매니폴드 끝을 팁하여 수행됩니다. </li></ol> 8. 수확 프로토콜 <ol><li> 수확 절차를 시작하려면 튜브는 수확 가방 어셈블리를 형성하기 위해 함께 세포 분리 솔루션과 담금질 가방을 용접. 모든 튜브 클램프이 닫힌 확인하십시오. (설명하기 만화를 사용) </li><li> 인큐베이터에서 H​​YPERStack 선박을 제거, 유지 밴드 아래에서 미디어 가방 출시하고, 가방 스탠드 만요. 부하 위치에 CSM에있는 혈관을 장소와 선박을 확보하기 위해 뚜껑을 조입니다. 지주 클램프에 환기 튜빙을 연결하여 입력 위치로 CSM 이동합니다. </li><li> 미디어 가방 관 그리고 미디어 첨부된 가방 흘러 수 있도록 선박의 액체 처리 튜브에 클램프를 열고, 가방 스탠드에있는 미디어 가방이 HYPERStack보다 낮은 걸려 있는지 확인 만들기. </li><li> 일단 혈관이 약 어 비어, 최종 빈 위치에 CSM 설정을 변경합니다. HYPERStack의 선박 및 액체 처리 튜브가 비어있는 경우 보낸 미디어 가방 튜브에 클램프 과거 미디어를 추적하기 위해 튜브를 들고 다음 액체 처리 튜브에 클램프 및 지출 미디어 가방 튜브에 클램프를 모두 닫습니다. </li><li> 튜브 용접에 의해 수확 가방 어셈블리와 함께 보낸 미디어 가방 교체하고 가방 스탠드를 사용하여 HYPERStack의 높이 위의 세포 분리 가방 조립의 높이를 올립니다. </li><li> 평균의 위치에 CSM를 놓습니다. 세포 분리 솔루션 관 HYPERStack에 솔루션을 클램프 및 전송 엽니다. 전송이 완료되면, 액체 처리 튜브 및 전지 분리 솔루션 튜브에 클램프를 닫습니다. </li><li> 부하 위치에 CSM을 가져와. 수평 위치 레버 열고으로 부드럽게 세포 레이어를 통해 솔루션을 배포, 바퀴를 사용하는쪽으로 선박 쪽 바위. 배는 가끔 솔루션의 동등한 분배를 유지하기 위해 락을 동안 평균 위치로 제공될 수 있습니다. 그것은 레이어가 완전히 코팅하는 시각 나타나지 않을 수도 있지만, 해리 솔루션은 균등 세포의 표면에 걸쳐 배포됩니다. 솔루션 적절하게 배포되면, 부하 위치에 HYPERStack을 잠글 수있는 CSM에있는 레버를 놓습니다. 이 위치에 HYPERStack를 남겨주세요당신의 세포에 필요한 분리 시간 동안. </li><li> 일단 세포가 분리가, 가이드로 탁도를 사용하여 평균 위치에 CSM 이동합니다. 치료는 이상 세포를 소화하지 않도록해야합니다. 담금질 미디어 선박을 입력 수 있도록 담금질 가방 클램프 및 HYPERStack 액체 처리 튜브 클램프를 엽니다. 전송이 완료되면 HYPERStack 액체 처리 튜브에 클램프를 닫습니다. </li><li> 부하 위치에 CSM을 반환하고 측면에 선박쪽으로 문제를 일으키고 수평 위치 레버를 잡아. </li><li> 가방 스탠드를 사용하여 HYPERStack의 수준 아래의 수확 가방 어셈블리의 위치를​​ 낮춥니다. 선박 액체 처리 관은 끄지 가방에 다시 셀 솔루션을 클램프 및 전송 열고, 빈 위치로 CSM을 조정합니다. 부하 위치에 CSM을 반환하고 튜브 실러를 사용하여 선박에서 수확 가방 어셈블리를 분리합니다. 세포 솔루션은 처리를위한 준비가 된 것입니다. </li></ol> 9. 대표 결과 <ul><li> 시간을 수확하면 가스 투과 폴리스티렌 표면에 표준 폴리스티렌 표면에서 변환시 최적화해야합니다. 세포는 HYPERStack 제품에 빠르게 출시하는 경향이있다. </li><li> 현미경으로 세포를 볼 수있는 통풍구와 액체 처리 튜브가 해제 고정되어 있어야합니다. manifolds는 현미경의 무대에서, 아래 방향으로 거꾸로 HYPERStack 용기를 놓습니다. </li><li> 예방 단계는 그들이 작동을 중지하게됩니다 사용하는 동안 필터를 젖음 방지로 이동하실 수 있습니다. 안으로 HYPERStack 선박을 입력하고 클램프가 열려있을 때 통풍구와 체이스 튜브가 고가 유지를 통해, 더 젖음가 발생해서는 안됩니다. </li><li> 튜브의 폐쇄 클램프의 압력은 클램프가 열린 후 그것이 닫힌 상​​태로됩니다. 반대 방향으로 튜브를 곤란하게하는 것은 그것을 열립니다. </li><li> 입력 및 중력 피드를 통해 HYPERStack 선박을 종료 미디어 흐름 시간은 HYPERStack 선박 미디어의 최상위 수준과 미디어 컨테이너 미디어의 최상위 레벨 사이의 미디어 높이 차이에 따라 달라집니다. 큰 거리, 흐름을 빠르게. 최대 유량은 1.5L/min하는 필터의 평가에 의해 제한됩니다. </li><li> HYPERStack 선박에 적절한 입력 볼륨을 유지하면 세포 성장 챔버의 공기 방울 형성​​을 방지할 수 있습니다. 공기 방울은 샘플링이나 증발 물의 손실로 인해 unhumidified 환경에서 잠복기로 인해 발생할 수 있습니다. 추가 유체는 최종 사용자가 추가되어야하는 경우뿐만 아니라 배양 조건으로 샘플링 금액 및 주파수 결정됩니다. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 표준 세포 배양 용기에서 미디어의 산소 고갈. 그림 3 일 동안 세포의 수준에 MG / L 산소의 감소를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 표준 세포 배양 용기에서 미디어에 산소 기울기. 그림은 산소의 MG / L은 셀 계층에서보다 상부 교차로에 미디어에서 가장 큰 것입니다 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 세포 성장 동안 HYPERStack의 tracheal 공간에 산소의 비율입니다. 그림 96 시간 이상, 각 기체 투과 필름 바닥을 공급 레이어 사이에 산소의 비율은, 지속적인 유지 보여줍니다. 이것은 confluency로 성장하는 동안 산소를 액세스하는 세포의 능력을 보여줍니다.

7,745,209 : HYPERStack 용기 가스 투과 기술은 미국 특허 #에 적용됩니다. 저자는이 문서에서 사용되는 악기를 생산하는 코닝 생명 과학, 병원의 직원입니다.

HYPERStack의 우주선이 성공적으로 성장, 기본 및 줄기 세포를 설계했습니다. 그릇에 액체를 첨가가 중력에 의해 공급하며 또한 살균 미디어 컨테이너에서 펌핑하여 무균 가방 연결을 통해 실시되었다. 혈관 성장 지역의 이상 증가 2.5X 대 같은 체적 면적의 스택 플레이트 제품을 제공합니다. HYPERStack - 12 6천cm이 성장 지역, HYPERStack - 36이 1만8천cm이 성장 지역 및 HYPERStack - 120 성장 지역의 6만cm이 있습니다.있다 표면적을 증가함으로써, 사용자는 동일한 세포 인구 또는 많은에서 더 많은 세포를 생산하고 다양성을 줄일 수 있습니다. 그들은 또한 동일한 셀 출력을 달성하거나, 사람, 청정실 스위트 또는 incubators을 추가하지 않고 셀 출력을 높이기 위해 적은 혈관을 사용하여 공간 및 / 또는 노동을 저장할 수 있습니다. 시스템은 낮은 입자 조립 방법과 접착제를 사용하지 않고 생산됩니다. 그것은 삼중 체포 및 살균 제공 튜브 세트 및 필터와 preassembled되는 폐쇄 시스템입니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.5L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>1350ml media + 150ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>4.0L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>3600ml media + 400ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-36</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filling Wedge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stack Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone/LonzA</td>
<td>SH3B0324.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Cell Dissociation Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

closed system cell culture protocol using hyperstack vessels with gas permeable material technology

대량 자기편 세포 배양은 microcarrier 비즈가 최적의 선택이 아닐 때 현재 스택 플레이트 세포 성장 제품을 표준화합니다. HYPERStack 선박은 현재 스택 플레이트 제품 폐쇄 시스템 규모를 허용하고 동일한 용적의 면적에&gt; 2.5X 더 많은 세포를 제공합니다. HYPERStack 선박 가스 교환이 발생할 수 있습니다 기체 투과 자료를 통해 기능은, 따라서 선박 내에서 내부 헤드 스페이스에 대한 필요가 없습니다. 헤드 스페이스의 제거는 세포 성장이 최소화 될 발생하는 구획이 동일한 체적의 풋프린트 내에서 세포 성장 표면 영역의 많은 레이어를 수 있도록 공간을 줄일 수 있습니다. 이러한 세포 치료 또는 예방 접종 생산 많은 어플 리케이션을 위해, 폐쇄 시스템은 세포 성장과 수확이 필요합니다. HYPERStack 선박 미디어 가방 또는 기타 방법으로 튜브를 통해 세포 및 시약뿐만 아니라 및 제거 가능합니다. 이 프로토콜은 세포, 폐쇄 시스템 세포의 성장 프로토콜, 다양한 수확 방법의 대사 요구를 충족하기 위해 HYPERStack의 선박, 가스 확산 결과에 사용되는 가스 투과 물질 뒤에 기술을 설명합니다.

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Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

기술, 프로토콜 및 높은 수율 자기편 세포 배양에 사용되는 코닝 HYPERStack의 선박 및 액세서리의 취급에 소개. 프로토콜은 현재의 스택 플레이트 제품 이상 증가 세포 수확에 대한 폐쇄 시스템 선박을 사용하는 방법을 보여줍니다.

가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.7K 조회수.  Corning Life Science. 기술, 프로토콜 및 높은 수율 자기편 세포 배양에 사용되는 코닝 HYPERStack의 선박 및 액세서리의 취급에 소개. 프로토콜은 현재의 스택 플레이트 제품 이상 증가 세포 수확에 대한 폐쇄 시스템 선박을 사용하는 방법을 보여줍니다.

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Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

특정 사이트 Recombinase (SSR) 기술의 원리

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

연구

생물학

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

공학 세포 투과 단백질

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

회전 형 바틀 문화 시스템을 사용 로던트 전체 엠브료 문화의 방법

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

샙터 셀 카운터를 사용하여 세포 배양 동안 휴대폰 번호를 결정

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Zebrafish의 유충 루시 페라 제 리포터 시스템과 글루코 코르티코이드 신호에 대한 화학적 스크리닝 절차

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...