상이한 에너지 기질의 사용은 세포 유형 특이적 및 질병 지시 둘 다이다. 특정 기질의 소비를 측정하면 정상적인 생물학과 병리학 모두에 빛을 비출 수 있습니다. 이 기술은 특수 장비가 필요하지 않으며 확장하기 쉽습니다.
또한 이전에 게시 된 방법보다 사용하기가 더 쉽습니다. 기질 산화율의 변화를 이해하면 대사 장애에 대한식이 및 약리학 적 개입의 개발을 허용 할 것입니다. 비록 뼈 조직으로 입증되었지만, 이 기술은 대사 이동의 원인과 결과에 대한 이해를 제공하는 모든 세포 유형에서 대사 유연성을 연구하기 위해 쉽게 맞춤화된다.
출생 후 삼 내지 오일 동안 새끼를 희생시킨 후, 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 얼음 차가운 D PBS로 옮긴다. 피부와 연조직을 제거하여 갈변을 노출시킵니다. D PBS에서 주위 조직을 뒤에서 앞쪽으로 절단하여 중간 영역을 수집한다.
칼바리아의 내부 및 외부 표면을 핀셋을 사용하여 부드럽게 긁어 후속 소화시 세포를 방출하는 데 도움을줍니다. 콜라게나제 유형 2의 밀리리터 용액 당 2 및 4 밀리그램을 D PBS로 준비하고 각 용액을 신선한 0.22 마이크로미터 필터로 여과한다. 먼저, 세척 된 갈변을 밀리리터 콜라게나제 용액 당 두 밀리그램으로 15 분 동안 소화 한 다음 소화 용액을 버립니다.
다음으로, 깨끗한 샘플을 매번 15분 동안 밀리리터 콜라게나제 용액 세 개당 네 밀리그램으로 소화한다. 그런 다음 소화 용액을 당겨 저장하십시오. 소화액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하고 여액을 300 RCF에서 5분 동안 원심분리한다.
세포 펠릿을 10%FBS 및 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 완전한 MEM 알파 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 10 센티미터 플레이트에 시드하십시오. 세포를 섭씨 37도 배양기에서 3 일 동안 5 % 이산화탄소로 배양하십시오.
그런 다음 섭씨 37도에서 세포를 0.25 트립신 EDTA와 해리시킵니다. 소화 후, 세포를 계수하고 10%FBS 및 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 완전한 MEM 알파 배지로 24웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 기질 당 세포 유형 당 적어도 네 개의 웰을 시드하고, 사전 분석 계수를 위해 각 세포 유형에 대해 적어도 세 개의 여분의 웰을 시드한다.
세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 여덟 주령의 생쥐에서 근육과 결합 조직을 제거하고 대퇴골과 흉골을 수집 한 후 날카로운 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자르고 버립니다. 하나의 대퇴골과 한 경골에서 골수를 10 % FBS 페니실린 스트렙토 마이신 이중 항생제 용액과 10 % CGM 14 12 컨디셔닝 배지가있는 완전한 MEM 알파 배지 15 밀리리터가 들어있는 23 게이지 바늘이 장착 된 주사기가 장착 된 신선한 10 센티미터 페트리 접시에 씻어 내십시오.
세포를 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도 배양기에서 페트리 접시에 배양하십시오. 사흘 후 배양 배지를 버리고 D PBS로 세포를 헹구었다. 부착 된 세포를 섭씨 37도에서 0.25 % 트립신 EDTA와 5 분 동안 해리시킵니다.
원심분리 후, 세포 펠릿을 BMM 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 이전에 기술된 절차에 따라 24 웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 분석을 시작하기 전에 BMM 배지에서 밤새 섭씨 37도에서 배양하였다.
여분의 웰에서 세포를 D PBS로 두 번 세척한다. 세포를 0.25 % 트립신 EDTA와 해리시킵니다. 소화된 세포 20 마이크로리터를 D PBS에 재현탁시킨다.
20 마이크로 리터의 아크리딘 오렌지와 프로피듐 요오드화물 염료 용액으로 자동화 된 세포 카운터로 살아있는 세포의 수를 결정하고 숫자를 기록하십시오. 분석 웰에서 세포를 D PBS로 두 번 세척한다. 500 마이크로리터의 고온 배지를 RAM 지정 조직 배양 후드의 각 분석 웰에 첨가한다.
플레이트를 파라필름으로 밀봉한 후, 세포를 섭씨 37도에서 RAM 지정 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 중에 여과지를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브의 캡 내부 영역보다 약간 큰 원형 조각으로 자르고 종이를 뚜껑에 꼭 삽입하십시오. 각 튜브에 1 몰 과염소산 200 마이크로 리터를 넣고 뚜껑 내부에 장착 된 여과지에 20 마이크로 리터의 수산화 나트륨을 넣으십시오.
세포를 배양한 후, 각 웰에서 400 마이크로리터의 배양 배지를 준비된 튜브로 옮기고 즉시 캡을 닫는다. 튜브를 실온에서 한 시간 동안 튜브 랙에 두십시오. 인큐베이션 중 Parallelae는 각 튜브에 대한 섬광 바이알을 설치하고 네 밀리리터의 섬광 유체로 채 웁니다.
여과지의 각 조각을 섬광 바이알로 옮기고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 조직 배양 후드, 수조, 냉장고, 인큐베이터, 싱크대, 접지 및 기타 작업 영역에서 잠재적인 RAM 오염에 대한 닦아 테스트를 수행합니다. 종이 물티슈를 섬광액이 들어있는 섬광 바이알에 넣으십시오.
섬광 계수기를 사용하여 섬광 바이알에서 탄소 14 전파 활동을 측정하고 판독 결과를 기록하십시오. 필요한 경우 방사선 안전 지침에 따라 작업 환경의 오염을 제거하십시오. 이 그림은 일차 칼바리아 예비 조골세포에 의한 기질 산화와 BMM을 비교합니다.
일차 세포가 계대배양되고 완전한 MEM 알파 배지에서 하룻밤 동안 배양된 후, 이들은 전형적으로 80 내지 90%컨플루언시에 도달하고 이들의 특징적인 형태학을 나타낸다. calvarial pre osteoblasts는 BMMs보다 현저하게 더 큽니다. 기질 산화의 결과는 각 기질에 대한 산화 속도가 BMMs보다 칼바리알 예비 조골세포에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었고, 이는 조골 전 세포에서의 산화 인산화에 의한 더 높은 에너지 생산을 나타낼 가능성이 높다.
삽입 된 세 번째 용지는 1.7 밀리리터 에빈 탑 튜브 캡보다 약간 커야합니다. 이 방법은 산소 소비와 함께 사용될 수 있으며 세포에서 산화 인산화 및 젖산 생산의 전체 속도를 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 별개의 분화 단계 또는 질병 설정 동안 기질 사용을 결정하는데 사용될 수 있다.
이 지식으로 우리는 신진 대사 장애에 대한 중재를 개발할 수 있습니다.
