이 프로토콜을 통해 ATP 의존성 크로마틴 리모델링 단백질에 의해 유도된 DNA의 두 번째 재구성의 변화를 시각화할 수 있습니다. DNA 구조의 변화는 전사 조절과 상관관계가 있을 수 있다. 이것은 올리고뉴클레오티드의 구조적 변화를 기록하기 위해 매우 적은 양의 순수 DNA를 사용하는 쉽고 매우 민감한 기술입니다.
이 방법은 ATP 의존크롬질 단백질에 의해 중재된 전사 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 시작하려면, 완충및 기타 반응 성분의 작업 농도를 신선하게 준비하고 반응을 설정하기 전에 섭씨 4도에서 보관한 다음 NADH 결합 산화 분석기를 사용하여 다른 DNA 분자의 존재시 단백질의 ATPase 활성을 측정합니다. 0.1 밀리몰러 ADAAD, 2개의 밀리몰러 ATP, 10 나노몰러 DNA 및 1X REG 버퍼를 96웰 플레이트에 혼합하여 250 마이크로리터의 최종 부피로 혼합합니다.
다음으로, 37도 인큐베이터에서 30분 동안 반응을 배양한 다음 마이크로플레이트 판독기와 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 NAD+의 양을 측정합니다. 340 나노미터에서 흡광도를 측정하려면 NADH 분석기를 클릭하고 96웰 플레이트를 기기의 플레이트 홀더에 놓고 판독 플레이트 버튼을 클릭하여 흡광도를 기록합니다. 투명도가 높은 쿼츠 큐벳에서 CD 스펙트럼을 수집합니다.
직사각형 또는 원통형 큐벳을 사용합니다. 큐벳을 청소하려면 물로 여러 번 씻은 다음 큐벳의 물 이나 버퍼스캔을 통해 깨끗한지 확인하십시오. 반응을 위해, PAGE 정제 된 DNA 올리고 뉴클레오티드를 사용합니다.
빠른 냉각을 위해 가열 블록에서 3 분 동안 94섭씨에서 DNA를 가열하고 얼음위에서 즉시 식힙니다. 느린 냉각을 위해, 3 분 동안 섭씨 94도에서 DNA를 가열 한 후 분당 섭씨 1도의 속도로 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 기준선 스펙트럼을 기록하려면 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 하나씩 총 5개의 대조군 반응을 설정합니다.
모든 반응에서 300 마이크로 리터의 반응 볼륨을 유지합니다. CD 스펙트럼을 기록하려면 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 하나씩 총 5개의 실험 반응을 설정합니다. 스캔을 기록하려면 가스를 켜고 CD 분광기를 켭니다.
10~15분 후 램프를 켜고 수조를 켜고 홀더 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 다음으로, CD 스펙트럼 소프트웨어를 열고 온도를 섭씨 37도로 설정하고, 파장 범위는 180~300나노미터로 설정하고, 포인트당 시간내지 0.5초로, 스캔 번호를 5로 설정한 다음, 프로 데이터 뷰어를 클릭하고, 새 파일을 만들고, 실험 및 날짜의 세부 정보로 이름을 바꿉니다. 다음으로, 배관하여 기준선과 실험 반응을 혼합하고 조심스럽게 반응을 큐벳에 하나씩 혼합하여 기포가 없도록 합니다.
시간 과정 실험을 수행하는 경우, 필요한 시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양한 다음 스캔을 수행하십시오. ATP 가수분해를 중지하기 위해 DNA, ATP, 마그네슘 및 단백질을 포함하는 완충제에 EDTA를 추가합니다. ATPase 활성을 완전히 억제하려면 EDTA 농도 및 인큐베이션 시간을 증가시면 됩니다.
소프트웨어의 해당 반응에서 기준선을 빼고 CD 스펙트럼 소프트웨어 또는 데이터 플로팅 소프트웨어에서 데이터를 부드럽게 한 다음 평균 잔류성 타원형에 대한 파장 그래프를 플롯하고 피크를 분석합니다. M-folds는 MYC DNA의 두 가닥이 줄기 루프와 같은 구조를 형성할 수 있음을 보여주었습니다. G 쿼드러플렉스 GECE를 포함하는 전방 및 역DNA 서열의 M 접이식 구조는 여기에 도시된다.
ATP와 ADAAD의 부재 와 존재에서 빠른 냉각 GECE의 CD 스펙트럼은 ADAAD가 258 나노미터에서 하나, 다른 하나는 210 나노미터에서 두 개의 긍정적 인 피크를 유도하는 것으로 나타났다. EDTA의 추가는 이 형태 변화를 무효화합니다. CD 스펙트럼은 이제 음수 210 나노미터 피크와 230 및 250 나노미터의 피크를 가진 광범위한 양성 대역을 가지고 있습니다.
QGRS 매퍼 및 M-fold 분석은 DROSHA, DGCR8 및 DICER의 프로모터 영역이 G 쿼드러플렉스 및 줄기와 같은 구조를 형성할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었습니다. DROSHA 쌍 5의 CD 스펙트럼은 ADAAD가 210 나노미터에서 음수 피크를 유도하고 260 나노미터에서 양성 피크를 유도한다는 것을 보여주었습니다. 이 스펙트럼은 ADNA의 특징입니다.
DGCR8 쌍의 CD 스펙트럼은 210 나노미터에서 양성 피크와 260 나노미터에서 넓은 음수 피크를 보였다. 이 스펙트럼은 B에서 X 로의 전환의 특징입니다. DGCR8 쌍 7의 경우 210 및 270 나노미터에서 강한 양성 피크와 250 나노미터의 음수 피크가 보였습니다.
이 스펙트럼은 병렬 G 쿼드러플렉스 DNA 구조의 특징입니다. 마지막으로, DICER 쌍 1의 경우 210 나노미터및 2개의 음수 피크에서 양성 피크가 230나노미터이고 다른 하나는 260 나노미터에서 관찰되었다. 이 봉우리들은 A에서 X DNA 전환의 특징입니다.
DNA와 단백질의 순도가 99% 이상인지 확인합니다. 큐벳은 깨끗해야 하며 기준선은 1밀리도 미만이어야 합니다. 배경이 1밀리도 미만이되도록 모든 시약은 순수해야 합니다.
