이 프로토콜은 단백질에 의한 ATP 가수분해로 인한 유리 인산염을 측정하여 ATPase 단백질에 대한 활성을 결정하는 데 도움이 됩니다. 말라카이트 그린 분석은 무기 인산염 검출을 위한 간단하고 민감하며 빠르고 저렴한 절차입니다. 표적에 대한 화합물의 자동화 및 고처리량 스크리닝에 적합합니다.
이 기술은 중요한 항암 표적인 Hsp90 단백질에 대한 억제제의 신속한 발견에 중요한 역할을 할 것입니다. 먼저, 40 마이크로리터의 1밀리몰 인산염 표준물을 960 마이크로리터의 초순수에 피펫팅하여 40 마이크로몰 인산염 용액을 얻는다. 제조업체의 지침에 따라 이 용액을 추가하여 0-40-마이크로몰에서 인산염의 연속 희석을 형성합니다.
다음으로, 측정 가능한 ATPase 활성을 위해 8 마이크로 리터의 효모 Hsp90을 사용하십시오. 말라카이트 그린 시약을 블랭크와 양성 대조군에 첨가하고, 첨가 후 블랭크와 양성 대조군 사이의 광학 밀도 차이가 0.5 이상 1 미만인지 확인한다. ATP를 준비하려면 1 밀리그램의 ATP를 453.39 마이크로 리터의 초순수가 들어있는 바이알에 옮겨 4 밀리몰 원액을 얻습니다.
ATP는 시간이 지남에 따라 자발적으로 가수 분해 될 수 있으므로 신선하게 준비하십시오. 4 마이크로리터의 ATP 저장 용액을 각 웰에 첨가하여 0.2-밀리몰의 최종 웰 농도를 제공합니다. 모든 반응이 동시에 시작되도록 다중 채널 피펫을 사용하여 ATP를 반응의 마지막 성분으로 추가합니다.
다음에, 1 밀리그램을 178.37 마이크로리터의 DMSO에 용해시켜 겔다나마이신의 10-밀리몰 스톡을 제조한다. 원액을 사용하여 연속 희석하여 DMSO에서 4 밀리몰, 0.8 밀리몰, 0.16 밀리몰, 0.032 밀리몰, 0.0064 밀리몰 및 0.00128 밀리몰 용액을 준비합니다. 0.1 밀리몰, 0.02 밀리몰, 0.04 밀리몰, 0.0008 밀리몰, 0.00016 밀리몰 및 0.000032 밀리몰의 최종 웰 농도를 얻기 위해 이러한 저장 용액 2 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하십시오.
그런 다음 블랭크 및 음성 대조군이 포함된 웰과 함께 웰을 준비합니다. geldanamycin을 함유 한 우물은 양성 대조군으로 작용합니다. 96-웰 플레이트를 준비하고, 이 파장에서 흡광도를 기록하기 위해 620 나노미터에서 흡광도를 나타내는 화합물에 대해 별도의 웰을 준비한다.
겔다나마이신은 이 분석에 사용된 농도에 대해 620나노미터에서 흡광도를 나타내지 않으므로 겔다나마이신에 대해 별도의 웰을 표시하지 마십시오. 각 웰에 초순수를 추가하여 분석 웰을 설정합니다. 그런 다음 필요한 양의 분석 완충액과 겔다나마이신 용액과 같은 복합 용액을 추가합니다.
Hsp90을 적절한 웰에 첨가하고 실온에서 플레이트 셰이커에서 2 분 동안 플레이트를 흔든다. 다중 채널 피펫을 사용하여 4 마이크로 리터의 ATP 용액을 추가하십시오. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 플레이트 셰이커에서 200rpm으로 실온에서 2분 동안 흔듭니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 다채널 피펫을 사용하여 ATP와 동일한 순서로 말라카이트 그린 시약 20마이크로리터를 첨가하여 반응을 중지하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 마지막으로, 플레이트 리더에서 620 나노미터에서 플레이트의 흡광도를 측정합니다.
플레이트 A에 추가하여, 각 웰에 90 마이크로리터의 분석 완충액을 첨가한다. 플레이트 B를 추가로, 각 웰에 Hsp90을 갖는 완충액 90 마이크로리터를 첨가한다. 플레이트 C에 90 마이크로리터의 ATP를 첨가하고, 플레이트 D에 90 마이크로리터의 말라카이트 그린 시약을 각 웰에 첨가한다.
자동화된 다중 채널 분주 시스템을 사용하여 첨가 플레이트 A의 각 웰에서 메인 플레이트 1과 2로, 플레이트 B에서 메인 플레이트 3과 4로 40마이크로리터의 용액을 옮깁니다. 20 마이크로리터의 용액을 복합 플레이트의 각 웰로부터 메인 플레이트 1, 메인 플레이트 2, 메인 플레이트 3 및 메인 플레이트 4로 옮긴다. 플레이트를 200rpm의 셰이커에서 1분 동안 흔든다.
20 마이크로리터의 용액을 첨가 플레이트 C의 각 웰로부터 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4로 옮긴다. 플레이트를 200rpm의 셰이커에서 1분 동안 흔든다. 플레이트를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양한 다음 20마이크로리터의 말라카이트 그린 시약을 첨가 플레이트 D에서 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4의 웰로 옮깁니다.
실온에서 15분간 배양한 후, 플레이트 리더에서 플레이트의 흡광도를 620 나노미터로 측정하였다. 말라카이트 그린의 구조와 말라카이트 그린 시약 A와 유리 인산염의 반응 및 시약 B와의 후속 반응이 여기에 표시됩니다. 표준 인산염 농도에 대한 표준 플롯이 이 그림에 나와 있습니다.
여기서, x축은 마이크로몰 단위의 유리 인산염 또는 파이 농도를 나타내고, y축은 620나노미터에서의 흡광도를 나타낸다. 오차 막대는 두 표본 번호 사이의 편차를 나타냅니다. 백분율 ATPase 활성은 겔다나마이신에 의한 단백질의 용량 의존적 억제를 측정하기 위해 사용된다.
겔다나마이신은 0.85-마이크로몰의 IC50 값으로 용량 의존적 방식으로 단백질을 억제하는 것이 관찰되었다. 여기서 각 점은 두 결정의 평균입니다. 말라카이트 그린 제제를 첨가한 후 메인 플레이트 1의 발색이 이 이미지에 나와 있습니다.
A11 웰의 분홍색은 복합 색상 때문입니다. 유사하게, 메인 플레이트 2의 색상 현상이 여기에 표시됩니다. A11 웰의 분홍색은 화합물의 착색 특성 때문입니다.
메인 플레이트 3과 메인 플레이트 4에 말라카이트 그린 시약을 첨가한 후의 발색이 여기에 나와 있습니다. ATP와 말라카이트 그린 시약을 모든 웰에 동시에 추가하는 것은 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 중요한 사항입니다.
