꼬리 출혈 모델은 실험 간의 재현성을 보장하기 위해 생체 내에서 지혈 화합물의 약리학 적 효과를 평가하는 중요한 도구가 될 수 있습니다. 다른 민감한 출혈 모델과 비교할 때, 우리 모델은 생존 대신 혈액 손실과 출혈 시간을 종점으로 사용합니다. 또한이 모델은 마취하에 수행되므로 동물의 통증과 고통을 줄입니다.
이 기술은 혈우병 및 기타 응고 장애에 대한 전임상 연구에 특히 유용한데, 이는 손상 후 혈액이 응고되고 출혈을 멈추는 능력을 측정하기 때문입니다. 우리는이 모델을 광범위하게 사용하여 혈우병 A 마우스를 사용하여 새로운 혈우병 치료법을 개발하기 위해 procoagulant 화합물을 테스트했습니다. 그러나, 혈우병이 항-인자 VIII 항체로 유도되는 다른 혈우병 마우스 균주, 또는 마우스가 또한 사용될 수 있다.
실험을 시연하는 것은 내 실험실의 전문 기술자 인 Sarah와 Dennis가 될 것입니다. 마우스를 마취 한 후 가열 플레이트에 놓고 코가 코 원뿔에 있는지 확인하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 적절한 눈 연고를 바르십시오.
꼬리 마크 블록을 사용하여 꼬리를 직경 2.5mm로 표시하고 꼬리를 슬릿에 밀어 넣지 않도록주의하고 꼭 맞는지 확인하십시오. 그런 다음 꼬리를 적어도 다섯 분 동안 식염수 튜브에 넣어 정맥 내 투여에 최적 인 따뜻한 꼬리 정맥을 확보하십시오. 필요한 경우, IV 투약은 다섯 분 후에 수행 할 수 있습니다.
그런 다음 열 손실을 줄이기 위해 마우스 위에 플라스틱 덮개를 놓습니다. 시험액 투약 후 5분 동안 꼬리를 잠근 상태로 두고, 꼬리를 절단 블록에 놓고 90도 돌려 정맥을 노출시켜 꼬리 정맥 횡단을 수행한다. 시험 용액이 투여 된 곳에서 반대쪽으로 절단하십시오.
꼬리를 잡고 절단 블록의 슬릿을 통해 숫자 11 메스 블레이드를 그려 출혈을 일으 킵니다. 그런 다음 즉시 꼬리를 식염수로 되돌리고 스톱워치를 재설정하십시오. 출혈은 즉시 볼 수 있어야합니다.
꼬리를 식염수에 담그는 것은 자유 공기에서 빨리 멈출 수 있기 때문에 지속적인 출혈에 중요합니다. 출혈을 관찰하고 혈류 표기법에 40 분 동안 출혈의 시작과 중지에 주석을 달으십시오. 절단이 이루어진 후 삼 분 이내에 원발성 출혈이 멈추지 않으면 마우스를 실격시키고 교체하십시오.이 출혈은 절단이 너무 깊거나 마우스가 원발성 지혈이 부족하다는 것을 나타낼 수 있습니다.
출혈이 없으면 꼬리 절단에 도전하십시오, 부상 후 10, 20, 30 분. 젖은 거즈 면봉을 사용하고 따뜻한 식염수를 사용하여 꼬리를 식염수에서 들어 올리고 젖은 거즈로 꼬리 컷 위의 원위 방향으로 부드럽지만 단단히 두 번 닦으십시오. 각 도전 후에 꼬리를 식염수 튜브에 즉시 다시 잠급니다.
실험이 끝나면 식염수에서 꼬리를 제거하고 원하는 경우 혈액 샘플을 수집하며 완전 마취 상태에있는 동안 마우스를 안락사시킵니다. 15-밀리리터 혈액 수집 튜브를 실온에서 5분 동안 4, 000배 G에서 식염수로 원심분리한다. 튜브에서 상청액을 버리십시오.
펠렛을 두 밀리리터의 적혈구 용해 용액에 재현탁하십시오. 그런 다음 밝은 커피 색상에 도달 할 때까지 최대 12 밀리리터의 용해 용액으로 희석하십시오. 총 부피를 주목하고 희석액의 두 밀리리터를 헤모글로빈 튜브로 옮깁니다.
헤모글로빈 분석이 이루어질 때까지 냉장 보관하십시오. 재조합 응고 인자 VIII 처리군에 대한 혈액 손실의 현저한 감소가 최적화된 프로토콜을 사용하여 관찰되었다. 킬로그램 당 20 국제 단위는 출혈을 완전히 정상화했으며, 킬로그램 당 10 IU는 상당한 효과를 일으켜 혈액 손실을 야생형 범위의 상한까지 거의 줄였습니다.
출혈 시간에 대해 유사한 결과가 관찰되었다. 킬로그램 그룹당 5, 10 및 20 IU에서 감소가 관찰되었으며, 킬로그램 그룹당 20 IU에서 완전히 정상화되었다. 야생형 마우스에서, 총 혈액 손실은 헤모글로빈의 200 내지 840 나노몰 범위였고, 비히클 마우스에서는 헤모글로빈의 5, 300 내지 7, 100 나노몰이었다.
평균 출혈은 비히클 처리된 마우스에서 5, 200 나노몰, 및 킬로그램 그룹당 20 IU에서 720 나노몰이었다. 야생형 마우스의 출혈 시간은 1분에서 9분 사이였으며 킬로그램당 10 및 20IU의 투여량 수준은 출혈 시간을 이 범위 내로 줄였습니다. 혈액 손실과 출혈 시간 사이의 강한 상관 관계가 결합 된 데이터에서 관찰되었습니다.
기록된 모든 출혈 에피소드는 각각의 개별 마우스에 대해 경험된 출혈의 길이와 수의 시각화를 제공하기 위해 플롯팅되었다. 비히클 그룹에서, 두 번째 도전 후에, 대부분의 동물들은 실험이 끝날 때까지 출혈을 계속한다. 혈장 인자 VIII 농도의 측정은 혈액 손실 및 출혈 시간을 감소시키는데 관찰된 효과가 재조합 인자 VIII 농도 의존적임을 확인하였다.
혈소판 수는 눈에 띄게 영향을 받지 않았으며 헤마토크릿 수치는 중간 및 더 높은 재조합 인자 VIII 투여량을 투여받은 동물에서는 정상 범위 내에 있었지만, 비히클 및 킬로그램 그룹당 하나의 IU와 같이 광범위하게 피를 흘린 동물에서는 상당히 낮았다. 심한 출혈을 경험하는 동물에서는 혈액 수, 특히 총 헤모글로빈 또는 헤마토크릿에 미치는 영향이 경미하게 발생할 수 있습니다. 이 최적화 된 모델에서 성별의 효과를 평가하기 위해 혈액 손실 및 출혈 시간 결과 모두 성별 및 복용량을 요인으로 사용하여 양방향 ANOVA 분석을 실시했습니다.
이 결과는 치료에 대한 반응이 성별마다 다르지 않다는 것을 나타냅니다. 꼬리의 올바른 마킹과 절단을 만드는 것은 출혈이없는 경우 도전과 마찬가지로 기술에서 신뢰성과 재현성을 보장하는 데 필수적인 단계입니다. 또한, 동물의 체온의 양호한 마취 유도 및 유지는 특히 적절하다.
우리는 또한이 모델을 사용하여 출혈을 유도 한 후 10 분 후에 인자 VIIA로 치료하여보다 주문형과 유사한 환경에서 확립 된 출혈의 중지를 조사했습니다.
