이 프로토콜은 신경근 병리를 조사하고 잠재적 치료제를 테스트하는 데 사용할 수 있는 기능적 3D 시험관내 인간 신경근 접합부를 엔지니어링하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 동시에 광유전학적 자극과 비디오 처리를 사용한다. 그것은 발달 중 및 중증 근무력증 환자의 신경 독소 및 혈청과 같은 외부 요인으로 인해 신경 근육 접합 기능의 변화를 정량화합니다.
근육 세포 및 운동 뉴런이 생물 반응기에 시딩되는 단계는 처음에는 어려울 수 있습니다. 콜라겐 겔 혼합물을 얼음 위에 유지하면 겔이 응고되기 전에 모든 세포를 시드하는 데 사용할 수 있는 시간을 연장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 폴리디메틸실록산 또는 PDMS의 경화제 혼합물에 10 대 1 염기를 혼합하고, 혼합물을 진공 챔버에 넣는다.
모든 밸브를 닫고 진공을 켜서 기포가 남지 않을 때까지 적어도 30 분 동안 혼합물을 탈기하십시오. 혼합물을 몰드에 붓고 진공 챔버에서 1 시간 동안 금형을 탈기 한 다음 금형의 상단 절반을 올바른 방향으로 닫습니다. 육각형 강철 막대를 중앙에 놓고 양쪽에 클램프를 놓습니다.
다음으로, 상단을 PDMS로 다시 채우고 금형을 섭씨 65도 오븐에서 최소 4 시간 동안 경화시킵니다. 금형이 실온으로 냉각 된 후 금형에서 플랫폼을 제거하십시오. 한편, 유리 커버가 1 % 비이온성 계면 활성제 폴리올에서 30 분 동안 미끄러 져 커버 슬립이 쌓이지 않고 모두 제대로 코팅되도록한 다음 증류수로 잘 헹구고 섭씨 65도에서 밤새 건조시킵니다.
유리 커버 슬립 및 PDMS 플랫폼을 높은 곳에서 플라즈마 클리너를 사용하여 분당 6 리터의 산소로 1 ~ 2 분 동안 처리하십시오. 일단 처리되면, PDMS를 적어도 30초 동안 커버 슬립 상에 아래로 눌러서 둘을 함께 결합시킨다. 밀리리터 당 3 밀리그램의 콜라겐 1 및 가용화된 기저막 매트릭스의 4-to-1 믹스를 준비한 다음, 이 갓 제조된 콜라겐 혼합물에 근아세포를 재현탁시켰다.
다음으로,이 세포 콜라겐 현탁액 15 마이크로 리터를 생물 반응기의 각 근육 챔버에 첨가하고, 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 두 기둥 전체에 걸쳐 확산시킵니다. 세포 겔 혼합물이 섭씨 37도에서 30분 동안 중합되도록 허용한 다음, 각 생물반응기 웰을 450 마이크로리터의 근긴장성 성장 배지로 채운다. motoneuron 분화의 11 일째에, 세포와 배지를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 신경 구가 5 분 동안 바닥에 정착하도록하십시오.
상청액을 흡인하고 세포를 뇌 유래 신경영양 인자 밀리리터당 20 나노그램 및 신경교세포 유래 신경영양 인자 밀리리터당 10 나노그램으로 보충된 모토뉴론 현탁액 배양 배지 15 밀리리터에 재현탁시킨다. 분화 프로토콜의 14일째에, 모토뉴런을 플랫폼에 시드한다. 가용화된 기저막 매트릭스 1 및 가용화된 콜라겐 1 당 2 밀리그램의 4-to-1 겔 혼합물을 제조한다.
400 나노 미터 세포 스트레이너를 사용하여 큰 신경 구를 선택하고 준비된 젤 혼합물에 재현탁하십시오. 저장소와 신경 영역 우물에서 조심스럽게 배지를 흡인 한 다음 15 마이크로 리터의 젤 혼합물을 신경 영역 채널에 첨가하십시오. 10 마이크로 리터의 젤로 10 마이크로 리터 피펫을로드하고 하나의 신경 구를 선택하십시오.
신경 구체를 신경 영역 채널에 증착하여 챔버에 있는지 확인한 다음 신경 영역이 침착되면 나머지 젤을 방출하면서 천천히 피펫을 들어 올립니다. 겔이 섭씨 37도에서 30 분 동안 중합되도록 한 다음 뇌 유래 신경 영양 인자 밀리리터 당 20 나노 그램과 아교 세포 유래 신경 영양 인자 밀리리터 당 10 나노 그램으로 보충 된 NbActiv4 450 마이크로 리터를 저장소에 첨가하십시오. 이미징의 경우 과학적 상보성 금속 산화물 반도체 카메라 소프트웨어와 함께 반전 형광 현미경을 사용하십시오.
비닝을 2x2, 노출 20밀리초, 롤링 셔터 켜기, 판독 속도를 540메가헤르츠, 동적 범위를 12비트, 게인 1 및 센서 모드를 겹치도록 설정합니다. 현미경에 2x 대물을 사용하여 미세 조직을 이미지화하고 현미경 단계에 살아있는 세포 챔버를 부착하십시오. 파일 크기와 처리 시간을 최소화하기 위해 신경질화된 골격 조직이 포함된 관심 영역을 선택한 다음, 샘플과 이미징 대상 사이에 594나노미터 길이의 통과 방출 필터를 배치하여 카메라에서 청색광 펄스를 필터링합니다.
다음으로, 4개의 생물반응기가 들어있는 직사각형 4-웰 플레이트를 라이브 셀 챔버에 넣은 다음, 라이브 뷰를 클릭하고 중앙을 클릭하고 원하는 ROI로 이미지를 집중시킵니다. GitHub 폴더에서 사용자 지정 매크로 코드를 다운로드하여 스테이지 위치, Arduino 보드 및 비디오 획득을 제어한 다음 출력 동영상을 일 밑줄 조직 그룹 밑줄 조직 이름 밑줄 실험 점 ND2로 설정합니다. 스테이지에서 원하는 X 및 Y 좌표를 설정한 매크로 코드를 실행하고 초당 50프레임에서 1700프레임으로 빠른 시간 경과를 얻습니다.
이미징 후 매체를 교체하고 샘플을 인큐베이터로 되돌립니다. 조직 피로를 피하기 위해 이미지 수집 세션 사이에 최소 24 시간을 허용하십시오. 동영상 처리의 경우 GitHub 폴더에서 파일을 다운로드하고 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용하여 배치 분석에서 비디오를 처리합니다.
재귀 OS 분석 스크립트를 열어 획득한 모든 비디오를 동일한 폴더에 저장합니다. 사전 분석 매개 변수를 조정하고 재귀 OSAnalysis 스크립트를 실행하여 병렬 처리를 통해 동영상을 분석합니다. 필요에 따라 기준선 시간, 피크 임계값, 최소-분 두드러기 및 최소-분 너비와 같은 사후 분석 매개 변수를 조정합니다.
마지막으로, 재귀 OSMovie를 실행하여 비디오 및 그래프 출력을 생성하여 각각의 수축성 추적을 가진 각 조직에 대한 비디오 파일을 생성합니다. 이 프로토콜은 서로 다른 스케일을 가진 두 개의 시스템, 약 20, 000개의 근모세포로 구성된 1밀리미터 길이의 골격근 조직을 산출하는 미세유체 장치 및 약 450개의 근모세포를 포함하는 4밀리미터 길이의 근육 조직을 생성하는 오픈 웰 생물반응기 시스템을 사용하여 테스트되었습니다. 청색광으로 모토뉴런의 제어된 자극을 허용하도록 광학 셋업이 구축되었으며, NMJ 기능은 커스텀 아두이노 코드와 짝을 이룬 커스텀 현미경 매크로 스크립트를 사용하여 상승되었다.
이 코드에는 조정 가능한 조정 가능한 매개 변수가 포함되어 있으며 광 펄스와 수축성 피크의 시작 사이의 시간을 기반으로 수축이 트리거되는지 여부를 결정합니다. 이 시스템은 조직 제작 후 일주일 후에 촉발된 반응의 증가를 나타내는 조직에서 NMJ 기능의 개선을 포착하고, 이어서 추가 일주일 동안 안정한 기능을 가졌다. 알파-분가로톡신은 모든 촉발되고 자발적인 수축을 멈추게 하여 NMJ 기능을 완전히 중단시켰으며, 이는 조직의 가벼운 자극이 기능적 NMJ를 필요로 한다는 것을 입증한다.
20%중증 근무력증 혈청을 48시간 동안 처리한 조직을 분석한 결과, 건강한 기증자로부터 혈청을 처리한 대조군 조직에 비해 기능이 감소한 것으로 나타났다. 혈청을 제거하고 세척한 지 48시간 후, 조작된 NMJs는 기능의 회복을 보여주었다. 배치 사이의 강성 변동성을 피하기 위해 모든 생물 반응기가 동일한 시간 동안 오븐에 있는지 확인하십시오.
또한 현미경을 사용하여 운동 뉴런 시딩을 확인하십시오. 이 절차에 따라, 메타발로믹스, 프로테오믹스 및 CRISPR 스크리닝을 수행하여 추가 정보를 수집하고 병든 혈청으로 인한 기계론적 변화를 더 잘 이해할 수 있습니다.
