미토콘드리아는 산화 인산화를 통해 세포 에너지를 제공하여 세포 내의 거의 모든 과정에 기여합니다. 결과적으로, 미토콘드리아 기능 장애는 광범위한 질병과 관련이 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 산소 소비에 의한 미토콘드리아 생물 에너지의 실시간 측정이며, 따라서 총 세포 에너지 대사의 정확한 평가입니다.
고분해능 호흡 측정법은 산화 인산화 시스템에서 무엇이 실패하고 있는지에 대한 직접적인 평가를 허용하여 잠재적으로 많은 장애와 관련된 원발성 미토콘드리아 질환 및 이차 미토콘드리아 기능 장애에 대한 진단 단서를 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Ryan Awadhpersad가 될 것입니다. 시작하려면 섭씨 37도에서 2.1 밀리리터의 미토콘드리아 호흡 매체에서 45 분 이상 호흡계를 실행하여 산소 교정을 수행하고 기준선 변동이 초당 4 피코몰 이내인 경우 진행하십시오.
HEK293 세포를 10% 열 활성화 FBS, GlutaMAX, 비필수 아미노산, 피루베이트 나트륨 및 우리딘이 보충된 고포도당 DMEM에서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 배양한다. 실험 당일, 세포를 수집하고 계수하고 2.5 밀리리터의 호흡 배지에 2.5 백만 개의 세포를 재현탁하십시오. 일상적인 호흡을 평가하려면 2.3 밀리리터의 따뜻한 호흡 배지 세포 현탁액을 챔버에 첨가하십시오.
챔버를 섭씨 37도에서 실행하고 교반 속도 700RPM으로 가동하십시오. 미디어가 가스 제거 될 수 있도록 적어도 세 분 동안 기다린 다음 회전 동작으로 스토퍼를 비틀어 챔버를 닫습니다. 다음으로, 마개 위에 여분의 액체를 흡인하십시오.
10분 후, 안정한 산소 플럭스 신호를 획득하여 호흡 루틴 또는 상태 I을 기록한다. 무손상 세포에서 OXPHOS 분석을 수행하려면 최종 농도 10나노몰에 대해 0.01밀리몰 올리고마이신 두 마이크로리터를 첨가한다. 호흡의 증가가 관찰되지 않고 호흡이 최대로 결합되지 않을 때까지 0.2 마이크로리터 단계에서 0.6 마이크로리터를 첨가하여 2-밀리몰 스톡으로부터 FCCP를 적정한다.
다음으로, 0.5 마이크로 몰의 최종 농도에 대해 한 밀리 몰 로테논 한 마이크로 리터를 추가하십시오. 그런 다음 밀리리터 당 하나의 마이크로 그램의 최종 농도에 대해 밀리리터 당 하나의 밀리그램의 항 마이신 스톡 당 하나의 밀리그램의 두 마이크로 리터를 추가하십시오. 플런저를 들어 올려 챔버를 동일한 산소 수준, 약 150-마이크로몰로 재산소화한다.
그 후, 0.8 몰 아스 코르 베이트의 다섯 마이크로 리터를 두 밀리 몰의 최종 농도에 첨가하십시오. 이어서, 0.5-밀리몰의 최종 농도에 대해 0.2-몰 TMPD의 5마이크로리터를 즉시 첨가하고, 콤플렉스 IV 활성을 평가하였다. TMPD로 피크 산소 플럭스에 도달하면 10 밀리몰의 최종 농도에 대해 다섯 마이크로 리터 또는 네 몰 아지드를 첨가하십시오.
이어서, 콤플렉스 IV 염기 수준 계산을 위해 TMPD의 자동 산화 검정을 위해 적어도 오분 동안 실행을 계속한다. 실행 후, 각 챔버로부터 1밀리리터의 샘플 현탁액을 수집하고, 투과화된 세포에 대해 1, 000 G 또는 조직 용해물에 대해 20, 000 G에서 원심분리한다. 이어서, 상청액을 버리고 추가 하류 분석을 위해 펠렛을 영하 80도에서 동결시킨다.
먼저, 개별 세포주의 성장 속도에 따라 세포를 시드한다. 올리고마이신, FCCP, 로테논 및 안티마이신을 각각 최종 농도인 1.5-마이크로몰, 1.125-마이크로몰 및 1-마이크로몰의 분석 배지에 희석한다. 그런 다음 별도의 포트에 채우십시오.
주입 포트를 관찰하여 샘플의 균일 한 로딩을 보장하십시오. 마이크로플레이트 기반 시스템과 컴퓨터를 켜고 섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 평형을 유지하십시오. 마이크로플레이트 기반 분석의 날에 세포 배양 플레이트의 컨플루언트, 세포의 형태를 확인하고 배경 웰이 비어 있는지 확인하십시오.
그런 다음, 각 웰로부터 20 마이크로리터의 배양 배지를 제외한 모든 것을 제거하였다. 그런 다음 각 웰을 90 마이크로리터의 분석 배지로 세척하고 100 마이크로리터의 분석 배지를 첨가하여 최대 120 마이크로리터의 최종 부피를 만듭니다. 다음에, 플레이트를 섭씨 37도에서 이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 60분 동안 인큐베이션한다.
인큐베이터에서 플레이트를 회수한 후, 뚜껑을 제거하고 마이크로플레이트를 슬롯에 놓는다. 계속을 클릭하여 실행을 시작하십시오. 실행이 끝난 후, 플레이트를 꺼내어 세포를 방해하지 않고 나머지 분석 배지를 제거하십시오.
그런 다음 전체 플레이트를 영하 80도에서 동결하십시오. 디지토닌 투과 및 호흡 실험을 수행한 후, 다수의 OXPHOS 결핍을 초래하는 CRISPR 매개 유전자 녹아웃을 갖는 야생형 HEK293 세포 및 HEK293 세포의 원시 산소 소비 흔적을 기록하였다. 오버레이된 세포 입력-정규화된 산소 소비 트레이스를 수득하였다.
CRISPR 녹아웃 1은 손상된 호흡을 나타내고, CRISPR 녹아웃 2는 세포 수로 정규화되었을 때 야생형에 비해 호흡을 나타내지 않는다. 단백질 양을 정량화하고 호흡 값을 호흡 상태 및 각각의 플럭스 조절 비율의 절대값을 결정하기 위해 단백질 양으로 정규화하였다. 세포외 산성화 속도는 CRISPR 녹아웃 2에서 OXPHOS 결핍에 대해 증가하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 증가된 당분해를 통한 HEK293 세포의 미토콘드리아 산화적 인산화 결핍의 보상을 시사한다.
또한, 호흡 값은 올리고마이신, FCCP 및 로테논의 존재하에 결정되었고, 얻어진 값은 단백질 양으로 정규화되었다. 단백질-다발성 OXPHOS 결핍을 야기하는 CRISPR 매개 미토콘드리아 번역 결핍을 갖는 야생형 HEK293 세포 및 HEK293 세포의 정상화된 산소 소비 흔적이 연구되었다. 습윤 중량 조직-정규화된 마우스 소뇌 및 마우스 발바닥 근육의 산소 소비 흔적이 수득되었다.
발바닥 근육은 소뇌보다 세 배 더 높은 OXPHOS와 호흡 능력을 보여줍니다. 챔버 기반 호흡 측정법을 사용하면 샘플을 수집하는 순간 미토콘드리아 기능이 감소하고 플레이트 기반 호흡 측정을 사용하면 변동성을 최소화하기 위해 최적의 시딩 밀도를 얻는 것이 중요하므로 신속하게 작동하는 것이 중요합니다. 추가 분석을 위해, 단백질 정량화 또는 면역-블롯팅이 가능하다.
이것은 미토콘드리아 호흡 기능의 변화가 OXPHOS 복합체의 풍부함 또는 미토콘드리아 양에 기인하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 이미 한 세기 전, 암세포는 미토콘드리아 OXPHOS 이외에 혐기성 글리코 분해를 수행하는 것으로 밝혀졌습니다. 이것은 미토콘드리아 생물 에너지학을 분석 할 필요성을 강조합니다.
여기서 우리는 오늘날의 황금 표준으로 간주되는 두 개의 호흡계를 시연했습니다.
