이 방법은 환경 및 인체 건강에 대한 독성 영향에 대한 우려로 인해 대부분의 살충제가 단계적으로 폐지되는 현재 상황을 감안할 때 상업적 농업 생태계에서 중요한 곤충 해충을 방제하기 위해 엔토모 병원성 곰팡이의 감염성 코니디아를 대량 생산하는 방법에 대한 새로운 정보를 제공합니다. 이 기술은 대량 생산 중에 EPF 코니디아의 최적 수율을 보장하기 위해 사용되는 방법을 설명합니다. 이 방법은 농업 생태계에서 살충제 내성 해충을 손상시키는 대규모 관리를위한 대량 생산 코니디아의 효과에 대한 통찰력을 제공함으로써 통합 해충 관리 및 생물학적 방제에 도움이됩니다.
이 절차는 Letodi Luki Mathulwe 박사, Nomakholwa Faith Stokwe 박사 및 Antoinette Paula Malan 교수가 개발하고 시연했습니다. 한 리터의 증류수를 가열하고 끓는점에 도달하기 전에 열을 끕니다. 이제 포도당 30 그램, 인산 칼륨 이염기성 네 그램, 효모 추출물 20 그램, 옥수수 침지액 15 밀리리터를 넣고 내용물을 2 ~ 3 분 동안 부드럽게 끓입니다.
총 100 밀리리터의 배지를 아홉 개의 다른 250 밀리리터 플라스크에 붓습니다. 각 플라스크에 면모 플러그를 놓고 마개로 알루미늄 호일로 면봉을 덮으십시오. 플라스크에서 매체를 섭씨 121도에서 55 분 동안 오토클레이브하십시오.
나중에 플라스크의 배지를 식히고 스트렙토 마이신 밀리리터 당 10 밀리그램을 각 플라스크의 배지에 첨가하십시오. EPF 단리물 모두에 대해 두 주에서 세 주 된 곰팡이 배양 플레이트에서 곰팡이 코니디아의 두 세 박테리아 루프를 수집하십시오. 곰팡이 코니디아를 멸균 조건 하에서 250 밀리리터 플라스크의 각 100 밀리리터의 액체 매체로 옮기고 플라스크를 밀봉하십시오.
액체 배양 플라스크를 약 섭씨 25도에서 140RPM의 오비탈 진탕기 상에서 사흘 동안 인큐베이션하고, 배양물이 곰팡이 블라스토포어 성장과 함께 높은 탁도의 징후를 보이면 배양을 중단한다. 배양물로부터 가능한 박테리아 오염을 검출하기 위해, 24시간 배양 후 각 액체 배양 플라스크로부터 100마이크로리터 샘플을 채취하고 단리물 당 세 개의 SDA 플레이트 상에 플레이트를 그린다. 플레이트를 섭씨 플러스 또는 영하 25도의 조절된 온도에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
작은 폴리 염화 비닐 폐기물 파이프를 사용하여 오토 클레이브 백의 열린 끝에 발효 백을위한 목을 만들고 오토클레이브 테이프를 사용하여 파이프를 고정하십시오. 발효 중에 충분한 가스 교환을 허용하기 위해 멸균 된 면직물 플러그로 파이프를 닫으십시오. 파끓인 긴 곡물 흰 쌀을 Metarhizium pinghaense와 Metarhizium robertsii의 블라스토 포자를위한 고체 기질 매질로 사용하십시오.
각 발효 백에 쌀 한 킬로그램과 멸균 증류수 300 밀리리터를 넣으십시오. 발효 백의 내용물을 부드럽게 섞으십시오. 외부 오토클레이브 백에 똑바로 세우고 섭씨 121도에서 55 분 동안 오토클레이브하십시오.
오토클레이빙 후, 기질이 멸균 조건 하에서 약 45분 동안 식히도록 한다. 층류 하에서 메타리지움 핑하엔스 및 메타리지움 로베르트시이 둘 다의 액체 배양 플라스크의 폐쇄를 제거하고 각 플라스크의 테두리를 10초 동안 화염시킨다. 목에서 면모 플러그를 제거하여 100 밀리리터의 액체 배양물을 발효 백에 붓습니다.
면 플러그를 다시 끼우고 고무 밴드로 고정된 수술용 종이로 가방의 목 꼭대기를 덮습니다. 가방의 윗부분을 비틀고 마사지로 기판을 흔들고 조작하여 가방의 내용물을 섞으십시오. 두꺼운 침대의 형성을 방지하기 위해 가방의 기질을 평평하게하여 약 섭씨 25도에서 가방을 배양하십시오.
접종 및 배양 후 이삼 일 후, 균사체 성장과 곰팡이에 의한 기질의 결합이 눈에 띄게 되었을 때, 봉지의 내용물을 마사지하여 발효 백의 기질을 깨뜨린다. 발효 후, 다공질 배양물을 26 ~ 30kg의 갈색 종이 봉지로 옮기고 시험에서 사용하기 전에 10-12 일 동안 곰팡이 배양물을 건조시킵니다. 종이 봉지의 인장 강도를 향상시키려면 가방 윗부분의 1/3을 수평으로 자르고 가방 바닥을 정렬하십시오.
각 발효 백의 기질을 부드럽게 무너 뜨립니다. 각 가방의 모서리를 자르고 잘라낸 모서리가 남긴 공간을 통해 전체 배양물을 종이 봉지로 천천히 옮깁니다. 각 종이 봉지에 라벨을 붙이고 각 가방의 상단 끝을 두 번 접은 다음 스테이플로 닫아 삼각형 텐트 구조를 만듭니다.
가방을 와이어 건조 랙에 올려 놓으면 섭씨 약 25 도의 통제 된 온도와 30 ~ 40 %의 낮은 습도에서 건조 할 수 있습니다.수집 팬에 장착 된 세 개의 중첩 된 체를 사용하여 배양물에서 곰팡이 코니디아를 수확하십시오. 건조 배양 샘플을 ETS 메쉬 번호 35에 천천히 로딩하고 체로 한다. 곰팡이 코니디아가 공기 중으로 방출되는 것을 막기 위해 체에 뚜껑을 놓습니다.
체에 10 ~ 12 개의 유리 대리석을 추가하여 메쉬 스크린을 통해 곰팡이 코니디아가 통과하도록 돕고 체에 conidia가 유지되지 않도록하여 포자 회복을 줄일 수 있습니다. 전기 테이프를 사용하여 체 조인트를 테이프로 붙이고 밀봉합니다. 체를 끈적 끈적한 패드가 장착 된 진동 쉐이커에 올려 놓고 수집 팬과 체를 분당 560 ~ 640 진동의 움직임으로 20 ~ 25 분 동안 고정시킵니다.
수집 팬에서 테스트 체를 제거하고, 코니디아를 수집하고, 수집 된 코니디아를 밀폐 및 불투과성 지퍼 잠금 백에 보관하여 장기간 보관하십시오. 평균 약 1.83 그램의 건조 Metarhizium robertsii conidia가 플레이크 보리 기질에서 수확 된 반면, Metarhizium pinghaense는 기질에서 수확되었습니다. 건조한 곰팡이 코니디아는 메타 리지움 종에 대한 조각난 귀리 기질에서 수확되지 않았습니다.
쌀알에서 수확한 그램 당 추정된 평균 코니디아에서 메타리지움의 두 종 사이에 유의한 차이가 관찰되었다. Metarhizium robertsii는 Metarhizium pinghaense보다 그램 당 평균 코니디아 수가 약간 더 높았습니다. 소비된 쌀 기질 상에 존재하는 코니디아의 추정된 수에서 메타리지움의 두 종 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
그러나, 메타리지움 핑하엔세는 메타리지움 로베르트시이보다 쌀 기질 상에서 약간 더 높은 코니디아를 가졌고, 두 종의 메타리지움에서 유의한 차이는 쌀 기질 배양물로부터 수득된 그들의 전체 코니디아 수율에서 추정된다. 그러나 Metarhizium pinghaense는 Metarhizium robertsii보다 약간 더 높은 코니디아 수율을 생성했으며, 이는 더 낮은 원추 수율을 생성했습니다. 이 기술의 도전적인 부분은 오염 된 블라스토 포자 접종으로 접종을 통한 기질 오염입니다.
따라서 작업하는 동안 항상 불임성을 보장하십시오. 이 데모는 학생들이 전체 프로세스를 종료 할 수있는 서투른 실수없이 기술을 효율적으로 재현 할 수 있도록 도와줍니다.
