미토콘드리아는 자신의 DNA를 가지고 있음에도 불구하고 핵 게놈에 크게 의존합니다. 따라서, 수입의 고도로 규제 된 메커니즘이 필요합니다. 이 방법은 프로세스와 외부 자극에 적응하는 방법을 연구하는 데 도움이됩니다.
이것은 미토콘드리아의 다양한 하위 구획으로 단백질 수입을 정량적으로 평가하는 데 사용할 수있는 유일한 생화학 기술입니다. 미토콘드리아의 생존력은 다양한 질병 상태에 연루되어 있으므로 단백질 수입이 어떻게 규제되는지 이해하는 것이 미토콘드리아를 대상으로 하는 새로운 치료 접근법에 기여하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미토콘드리아의 생존력과 무결성을 보장하기 위해 격리 중에 추가주의가 필요합니다.
조직의 철저한 다진 및 모든 후속 펠릿을 부드럽게 재중단하는 것이 필요합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 애슐리 올리베이라 (Ashley Oliveira)가 될 것입니다. 골격 근육에서 미토콘드리아의 격리를 시작하려면 근육에서 지방 및 결합 조직을 제거하고 균일 한 슬러리가 될 때까지 미리 냉각 된 시계 유리에 조직을 다진다.
다진 조직을 미리 냉각된 50밀리리터 플라스틱 원심분리 튜브에 놓고 정확한 무게를 기록합니다. 그런 다음, ATP를 포함하는 완충제 1로 다진 조직을 10배 희석시켰다. 8mm 트윈 블레이드 균질화기를 사용하여 9.8 Hertz의 출력에서 근육 샘플을 10초 동안 균질화하여 눈에 띄는 근육 덩어리가 남지 않도록 합니다.
9, 000x G에서 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 회전한 후, 환액 배지의 약 95 마이크로리터에서 펠릿을 조심스럽게 재연한다. 상체를 폐기하기 전에 샘플을 원심 분리하고 P-200 파이펫을 사용하여 약 180 마이크로리터의 재서스펜션 배지로 펠릿을 부드럽게 재중단합니다. 체외 번역의 경우, 수입 실험과 번역 레인에 사용할 미토콘드리아 샘플 당 20 마이크로 리터를 공급하기에 충분한 번역 반응 믹스를 준비하십시오.
인큐베이션에 대한 반응을 섭씨 30도에서 30분간 배치합니다. 번역 반응이 시작된 후 15분 후, 10분 동안 30도에서 멸균 튜브 1.5밀리리터 튜브에 미토콘드리아 90 마이크로그램을 알리쿼트하고 사전 배양합니다. 멸균 1.5 밀리리터 튜브의 신선한 세트에서, 번역 반응의 18 마이크로 리터와 미토콘드리아의 75 마이크로 그램을 결합하고 원하는 시간 동안 섭씨 30도에서 튜브를 배양.
번역 반응의 나머지 볼륨을 얼음에 보관합니다. 적절한 인큐베이션 시간 후에 수입 반응을 종료하려면 튜브를 섭씨 30도에서 제거하여 얼음 위에 놓고 자당 쿠션으로 튜브 위에 수입 반응을 조심스럽게 옮겨냅니다. 17, 000x G의 자당 쿠션으로 샘플을 섭씨 4도에서 15분간 원심분리합니다.
P-1000 파이펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 외부 멤브레인으로 수입하려면 Tom40에 사용하여 반응을 수행하고, 새로 준비된 0.1-대구 나트륨 탄산나트륨의 50 마이크로리터로 펠릿을 재보중단하고 30분 동안 얼음에 배양한다. 인큐베이션에 따라 샘플을 섭씨 4도에서 5분간 14, 000x G에서 원심분리합니다.
다음으로, 원고에 설명된 대로 SDS-PAGE 전기전에 대한 샘플을 준비한다. 잔류 번역 반응의 마이크로리터 3개와 리시스 버퍼 37마이크로리터 및 5개의 미세리터의 시료 염료를 혼합하여 제어 번역 차선을 준비한다. 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓이고, 미토콘드리아펠을 피하기 위해 저속으로 부드럽게 회전합니다.
SDS 폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 적용한 후, 젤을 5%트리클로로아세트산 또는 TCA로 끓여 서 서지속적으로 교반하여 5분간 연기 후드에 넣고 끓입니다. 그런 다음 젤을 회전 판에 분당 50회전시 1분간 이중 증류수로 놓습니다. 젤을 10밀리머 트리스로 회전 플레이트에 분당 50회전으로 5분간 세척합니다.
단백질을 침전시키기 위해 젤을 한 해금 살리Cytic 산의 충분한 양으로 씻어 30 분 동안 회전 판에 젤을 덮습니다. 젤을 탈수하려면 젤 건조기의 다공성 침대에 큰 얼룩진 종이를 놓고 젤이 적용되는 지역에 종이 타월 1 장을 놓습니다. 그런 다음 11센티미터를 9센티미터씩 잘라서 종이 타월에 종이를 놓습니다.
11센티미터 x 9센티미터 의 두 번째 조각을 사용하여 용기에서 젤을 떠서 첫 번째 조각 위에 평평하게 올려 놓습니다. 약간 더 큰 플라스틱 조각을 젤에 내려 놓고 주름이나 거품이 없는 것을 방지합니다. 그런 다음 젤 건조기의 플라스틱 커버를 랩 상단위에 놓습니다.
진공을 켭니다. 플라스틱 커버의 모서리를 들어 올리고 덮개가 다시 밀봉되기를 기다리며 플라스틱 덮개가 씰을 형성했는지 확인하십시오. 젤 드라이어를 닫고 90분간 달릴 수 있으며, 섭씨 30도에서 시작하여 점차 섭씨 80도에 도달하고 달리기가 끝나면 섭씨 30도까지 돌아갑니다.
건조 공정에 사용되는 플라스틱 랩에 젤을 감쌉니다. 탈수되면 젤은 고화되어 종이처럼 얇습니다. 탈수된 젤을 카세트에 인 필름을 얹습니다.
인 이미징이 가능한 적합한 글리저로 사인 방사선 촬영을 사용하여 젤을 시각화하기 전에 24 시간 동안 필름을 노출하십시오. 대표적인 분석은 말산 탈수소 효소, 또는 MDH에 대한 수입의 정상적인 비율을 보여 주며, 서브사콜렘말 및 인터미오피브릴라 미토콘드리아, 및 전구체 MDH의 번역 산물이다. 발리노마이신의 첨가는 SS와 IMF 미토콘드리아의 매트릭스로 MDH 단백질 수입을 억제하였다.
마찬가지로, 세제 트리톤 X는 내부 막의 용해성으로 인해 두 하위 분획으로 MDH 수입을 억제하였다. 단백질 수입의 추정은 시간 지속 시간을 증가시키기 위해 수행되었으며, 그 결과 데이터는 수입이 시간 의존적 과정이며, SS 및 IMF 미토콘드리아는 수입에 대해 서로 다른 속도 또는 용량을 가지고 있음을 보여 주었다. 쥐가 전기 자극을 받았을 때, 톰 40은 대조군과 비교하여 만성 자극된 동물로부터 근육이 더 높았다.
Ornithine transcarbamylase, 또는 OCT 가져오기, 미토콘드리아 매트릭스로, 인큐베이션의 매 시점에서 증가, 만성 자극 근육에서 미토콘드리아의 1.4 배 증가의 결과. 단백질 수입은 미토콘드리아 함량의 지수와 긍정적으로 상관관계가 있었고 COX 활성에 의해 평가되었다. 미토콘드리아 매개 세포사멸을 조사하는 과정에서, 박병과 박이중 녹아웃 동물은 미토콘드리아 매트릭스로 단백질 수입을 감소시켰다.
6주 간의 자발적 인 바퀴 가실행은 이중 녹아웃 동물의 수입 결함을 구출했습니다. 수입 반응의 지속 기간 및 어떤 단백질을 수입할 지 와 같은 변수를 고려하는 것이 중요합니다. 세포분획은 세포성 요인이 수입 속도에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하기 위해 반응에 통합될 수 있다.
대안적으로, 단백질은 단백질이 선택적으로 수입될 수 있는 방법을 이해하기 위하여 잠복하기 전에 변형될 수 있습니다. 이 기술은 각종 질병 국가에 나타날 수 있는 미토콘드리아 근병증의 복잡한 병리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
