무수한 미생물이 식물 뿌리를 식민지화하지만, 이러한 상호 작용은 지하에서 일어날 때 분석하기가 어렵습니다. 이를 용이하게하기 위해이 프로토콜 수집은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 개요를 제공합니다. 뿌리 접종은 뿌리 미생물 상호작용을 연구하기 위한 기초이며, 다음의 기술을 사용함으로써, 상호작용은 분자적, 세포학적 또는 조직학적 수준에서 연구될 수 있다.
우리는 뿌리 침입 미생물로 verticillium을 사용하는 세 가지 접종 시스템과 모델 식물 인 애기장대에 대해 설명합니다. 그러나, 상기 방법을 토마토 또는 유채 유채와 같은 다른 식물, 및 다른 뿌리 미생물, 예를 들어 유익한 세렌디피타로의 이송이 가능하다. PDB에서 균사체를 배양하고 다공 및 Czapek 덱스트로스 배양액을 유도하여 버티실륨 접종물을 미리 준비한다.
그런 다음 오토클레이브 된 매체를 페트리 접시에 붓는 것으로 시작하십시오. 매체를 경화 한 후 페트리 접시를 멸균 비닐 봉지에 다시 포장하고 섭씨 4 ~ 10도의 냉장고에 밤새 거꾸로 보관하십시오. 메스로 고형화된 배지의 상부 삼분의 일에 있는 감염 채널을 절단하고 제거한다.
절단하는 동안 한천 매체 아래에 액체나 공기가 들어가지 않도록 하십시오. 다음으로, 멸균 피펫 팁을 사용하여 절단 상면에 50 ~ 100 표면 멸균 애기장대 종자를 분배하십시오. 절단 된 한천 표면이 Petri 접시 벽과 접촉하는 각도에 씨앗을 넣어 뿌리가 그들 사이에서 자랄 수 있도록하십시오.
페트리 접시를 닫고 통기성 접착 테이프로 밀봉하여 가스 교환을 허용합니다. 페트리 접시를 이틀간 섭씨 네 도에서 어둠 속에 보관하여 계층화하여 동기화되고 효율적인 발아를 보장합니다. 그런 다음 플레이트를 랙에 수직으로 놓고 긴 하루 조건 하에서 성장 챔버에서 식물을 자랍니다.
뿌리가 감염 채널에 도달하면 9 일에서 11 일 후에 플레이트를 수평으로 놓고 엽니 다. 그런 다음 갓 수확 한 Verticillium conidia의 500 마이크로 리터를 감염 채널에 직접 넣으십시오. 포자 대신 모의 용액 500 마이크로 리터를 첨가하여 제어 플레이트를 준비하십시오.
대조군 및 포자 접종된 플레이트 둘 다를 액체가 흡수될 때까지 수평으로 인큐베이션한다. 그런 다음 뚜껑을 닫고 통기성 접착 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 뿌리와 토양 매개 곰팡이를 어둡게하기 위해 검은 종이 상자로 뿌리 부분을 덮으십시오.
플레이트를 성장 챔버 내에서 수직으로 인큐베이션한다. 접종 후 바람직한 시점에서 분석을 수행하십시오. 먼저 투명한 500 밀리리터 플라스틱 컵을 70 ~ 75 % 에탄올 욕조에 넣고 20 분 동안 살균하십시오.
라미나 흐름 후드에서 컵을 말리십시오. 오토클레이브 매체를 플라스틱 컵에 붓습니다. 다섯 개의 사전 제작 된 구멍이있는 플라스틱 층을 중앙에 큰 구멍과 각 모서리에 네 개의 작은 구멍으로 준비하십시오.
플라스틱 층이 응고되기 전에 매체에 놓습니다. 미리 제작 된 중앙 구멍을 통해 메스로 한천을 약 1.5 센티미터의 깊이로 자릅니다. 절단 된 한천을 제거하여 감염 채널을 만들어 나중에 곰팡이 포자를 추가하십시오.
네 개의 작은 구멍에 피펫 팁으로 한천 배지를 약간 긁어 응고 된 피부를 방해하십시오. 피펫 팁을 사용하여 씨앗을 작은 구멍에 넣으십시오. 두 번째 거꾸로 된 플라스틱 컵으로 플라스틱 컵을 닫고 통기성 접착 테이프로 밀봉하십시오.
층화를 위해 어둠 속에서 사흘 동안 식물을 섭씨 네 도에 두십시오. 그런 다음 컵 시스템을 성장 챔버에서 인큐베이션하십시오. 식물 줄기에 verticillium을 접종하려면 감염 채널에 한 밀리리터의 코니디아 용액을 첨가하십시오.
컨트롤의 경우 모의 솔루션으로 한 밀리리터의 세균이없는 네 번째 MS 배지를 추가하십시오. 접종 후 바람직한 시점에서 분석을 수행하십시오. 첫째, 토양과 모래를 세 대 하나의 부피 비율로 철저히 혼합하여 나중에 뿌리에서 기질을 쉽게 씻을 수 있습니다.
혼합물을 오토클레이브 백에 붓고 오토클레이브에서 20 분 동안 섭씨 80도에서 증기를 뿜어냅니다. 냄비에 흙 - 모래 혼합물을 채우고 쟁반으로 옮깁니다. 토양 - 모래 혼합물의 균일 한 담그기 위해 냄비 높이의 삼분의 일 정도에 트레이에 물을 넣으십시오.
젖은 시작 조건을 보장하기 위해 혼합물을 물 분무. 서로 충분한 거리에서 각 냄비에 서너 개의 씨앗을 뿌리십시오. 어둠 속에서 사흘 동안 섭씨 네 도에서 층화를 위해 보관하십시오.
묘목이 규칙적인 급수로 긴 하루 조건에서 자라도록 허용 한 다음 비슷한 크기와 나이의 식물을 골라 뿌리 딥 접종을 수행하십시오. 냄비에서 토양을 꺼내 뿌리를 굴착하십시오. 물 용기에 뿌리를 부드럽게 씻고 로제트를 물에서 꺼내십시오.
뿌리를 버티실륨 포자 용액 또는 모의 용액이 들어있는 페트리 접시에서 60 분 동안 인큐베이션하십시오. 모래가없는 축축한 증기 살균 토양으로 새 냄비를 준비하십시오. 피펫 팁을 사용하여 각 냄비의 토양 중앙에 구멍을 뚫습니다.
뿌리를 구멍에 직접 넣고 식물에 대한 추가 스트레스를 피하기 위해 토양으로 부드럽게 구멍을 다시 채 웁니다. 정기적 인 급수로 긴 하루 조건에서 식물을 재배하십시오. 접종 후 바람직한 시점에서 분석을 수행하십시오.
페트리 접시 기반 시스템에서, 버티실륨의 성공적인 감염은 애기장대의 뿌리에서 시각화되었습니다. 접종 이틀 후, 마커 유전자 MYB51은 대조군에 비해 감염된 뿌리에서 강하게 유도되었으며, QRTPCR 분석을 통해 확인하였다. 컵 기반 시스템에서, 접종 12일 후 모의 대조군과 비교하여 그래프가 보여주는 바와 같이 감염된 식물의 잎에서 많은 양의 진균 DNA가 발견되었다.
QRTPCR 분석은 애기장대 뿌리에서 마커 유전자 MYB51의 풍부한 전사체 풍부함을 보여주었다. 이 시스템을 사용하여, 버티실륨을 다른 모델 식물 종에 접종하였다. 유채 유채에서, 진균 DNA는 뿌리에 접종 12일 후에 묘목의 기저부에서 절단된 줄기 분절에서 검출가능하였다.
곰팡이 DNA는 또한 식물 내에서 병원균의 번식을 나타내는 토마토 줄기에서 검출되었다. 토양계 시스템을 이용한 접종 21일 후, 모의 처리된 애기장대 식물의 로제트는 건강하고 녹색으로 보인 반면, 감염된 식물은 황색 또는 괴사성 잎을 보이며 모의에 비해 녹색 잎 면적이 적어 성공적인 감염을 나타냈다. 한천이 미끄러지는 것을 방지하기 위해 페트리 접시 시스템에서 감염 채널을 절단 할 때주의하십시오.
토양 기반 시스템을 적용하면 식물에 대한 추가 스트레스를 피하기 위해 리포팅하는 동안 뿌리 주위의 토양을 압축하지 마십시오. 뿌리 접종 후, 예를 들어, 병원성 검사, 유전자 발현 분석, 기능적 유전체학 또는 농약 검사를 수행하여 뿌리 미생물 상호 작용에 대한 새로운 통찰력과 농업을 개선하기위한 도구를 제공 할 수 있습니다.
