이 프로토콜은 기생 식물의 조직과 현미경 촬영을 사용하여 분석할 샘플의 숙주 사이의 대비를 상당히 향상시킵니다. 여기에 설명된 기술은 샘플을 통한 대비 관류 과정을 가속화하여 기생 식물과 숙주 사이에 형성된 특정 조직 및 구조를 분석할 수 있습니다. 진공 접근 방식은 매우 간단하며 어려움이 없어야 합니다.
반면에 관류 장치는 설정하기가 약간 어려울 수 있습니다. 그러나 미리 연습하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 목질이 아닌 작은 샘플의 경우 진공 방법을 사용하여 적용할 수 있습니다.
증식 방법은 숙주 줄기 또는 뿌리의 일부를 포함하여 더 크고 목질인 샘플에 사용해야 합니다. 진공 방법을 사용하는 경우 대조 용액이 들어 있는 바이알에 샘플을 넣습니다. 그런 다음 바이알을 진공 챔버 또는 진공 펌프에 연결된 데시케이터에 놓습니다.
바이알에서 뚜껑을 제거하고 진공 챔버 또는 건조기를 닫습니다. 진공 챔버 또는 건조기에 균열이 없는지 확인하십시오. 챔버 또는 데시케이터의 배출 밸브를 열어 공기를 강제로 빼냅니다.
펌프를 켜고 압력이 약 20인치 또는 10psi에 도달할 때까지 기다립니다. 챔버 또는 데시케이터 배기 밸브를 닫아 공기가 다시 들어가지 않도록 합니다. 그런 다음 펌프를 빨리 끕니다.
샘플을 최소 2시간 동안 진공 상태로 두십시오. 풍부 방법을 사용하는 경우 샘플 크기에 따라 공급 탱크를 선택하십시오. 작은 샘플의 경우 바늘이없는 50 밀리리터 주사기를 탱크로 사용할 수 있습니다.
투명 플라스틱 튜브의 한쪽 끝을 공급 탱크에 연결합니다. 그런 다음 다른 쪽 끝을 양방향 또는 3방향 밸브에 연결합니다. 두 번째 튜브를 밸브의 다른 배출구에 연결합니다.
이전 단계에서 설정한 장치를 분해하지 않고 높은 위치에 공급 탱크를 고정하십시오. 액체가 튜빙 시스템에서 빠져나가는 것을 방지하기 위해 3방향 또는 양방향 밸브를 닫고 대조 용액을 공급 탱크에 붓습니다. 튜빙 시스템에 큰 기포가 없는지 확인하고 밸브를 다시 닫고 장치를 제자리에 둡니다.
조영 용액의 풍부함을 위해 샘플을 준비하려면 액체에 담그고 숙주 줄기 또는 뿌리의 근위 끝 끝을 잘라냅니다. 대조 용액이 천천히 흐르도록 밸브를 조심스럽게 열고 대조 용액이 쏟아지는 것을 방지하기 위해 시스템의 열린 끝을 약간 높은 위치로 유지하면서 탱크에 연결된 플라스틱 튜브를 채웁니다. 샘플의 호스트 줄기 또는 뿌리의 근위 끝을 튜브 시스템의 열린 끝에 연결합니다.
용액이 샘플을 최소 2시간 동안 또는 용액이 용기 내부에 축적될 때까지 관류하도록 합니다. 밸브를 닫고 장치에서 샘플을 조심스럽게 분리하십시오. 샘플을 물에 2분 동안 담가 세척합니다.
샘플을 실온에서 종이 타월에 넣어 샘플이 완전히 마르지 않도록 2-5분 동안 과도한 물이 증발하도록 합니다. 샘플을 파라핀 필름으로 감싸고 샘플 위에 필름을 접지 마십시오. Micro-CT 스캐닝은 기생 식물의 복잡한 구조와 숙주와의 상호 작용을 비파괴적인 3차원 방식으로 더 잘 이해하는 데 활용할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 다양한 마이크로 CT 시스템에서 작동합니다. 그러나 설정 및 매개 변수는 시스템 및 샘플에 따라 다릅니다. 3D X선 현미경 이미지는 기생충 숙주 경계면에서 조직 조직과 토폴로지를 분석하기 위해 광학 현미경으로 관찰한 해부학적 절편만큼 효과적이었습니다.
조영제의 차등 흡수로 인한 밝은 흰색과 짙은 회색의 색상 차이에 기초하여, haustorium의 혈관 코어를 둘러싼 실질의 풍부함을 관찰 할 수 있습니다. 혈관 코어는 두 개의 혈관 가닥이 실질에 의해 분리되어 있기 때문에 단면에서 쉽게 관찰됩니다. 즙이 많은 숙주 식물 내부에서 자라는 내부 기생충 Viscum minimum은 탄수화물을 전분 형태로 저장하는 실질 세포를 보여주었습니다.
요오드 흡수의 차이는 숙주 체 내의 내부 기생충에 의해 형성된 피질 가닥의 복잡한 웹을 검출 할 수있게 해주었다. Cuscuta Americana와 Struthantus marcianus에 대해 얻은 결과는 각각 작은 샘플과 큰 샘플에 대한 현미경 단층 촬영 접근법의 편리함을 설명하는 데 도움이 됩니다. 가상 연속 절편 시벨륨 균류는 숙주 뿌리의 혈관이 기생충 괴경으로 분기되고 두 식물 사이의 목부 연속성은 천공판을 통한 혈관 간 연결에 의해 형성된다는 것을 보여주었습니다.
여기에 설명된 절차는 가상 분할과 같은 다른 기술과 결합하여 기생 식물과 숙주 사이의 연결의 3차원 구조에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술은 내부 기생충의 발달과 과기생 연결의 기능을 포함하여 기생 식물의 생물학의 다양한 측면을 분석하는 길을 열었습니다.
