우리가 개발한 이 프로토콜은 시아노박테리아와 그들의 방출된 제품, 즉 세포외 탄수화물 폴리머 및 단백질에 있는 분비 기계장치를 공부하는 것이 중요합니다. 생성 된 지식은 우리가 여러 응용 프로그램에 대한 이러한 제품을 사용자 정의 할 수 있습니다, 즉 생명 공학 및 생물 의학 응용 프로그램. 이러한 프로토콜은 매우 간단합니다.
그들은 생산 유기체, 사용자의 요구 및 제품의 최종 응용 프로그램에 따라 조정할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 주요 장점은 다른 살아있는 시스템, 특히 다른 박테리아에 쉽게 적응할 수 있다는 것입니다. 이러한 프로토콜은 쉽습니다.
그러나, 하나는 세균성 긴장 또는 요구되는 순도의 정도에 따라 몇몇 변경을 소개할 필요가 있을 수 있습니다. 시작하려면 표준 조건에서 치아노균 균주를 재배하십시오. 표준 프로토콜을 사용하여 성장을 측정합니다.
다음으로, 투석막으로 문화를 옮기고, 연속 교반으로 24시간 동안 최소 10권의 탈온수에 투석한다. 원심 분리는 15 분 동안 섭씨 4도에서 15, 000 배 g에서 문화를 원심 분리합니다. 상체를 새로운 바이알로 옮기고 펠릿을 버립니다.
원심분리기는 15분 동안 섭씨 4도에서 20, 000배 g에서 다시 20g, 세포벽 파편 또는 리포폴리사카라이드와 같은 오염물질을 제거합니다. 원심 분리 후, 상체를 유리 비커로 옮기고 펠릿을 버린다. 중합체를 침전시키기 위해, 상체에 96%에탄올의 두 부피를 추가하고, 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 서스펜션을 배양한다.
작거나 눈에 보이지 않는 양의 침전 된 폴리머의 경우, 25 분 동안 섭씨 4도에서 13, 000 배 에서 서스펜션을 원심 분리합니다. 상체를 부드럽게 버리고, 오토클레이브 디온화 된 물의 1 ~ 2 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다. 수성 서스펜션을 바이알로 옮기는다.
눈에 띄는 다량의 침전 된 폴리머의 경우 멸균 금속 집게를 가진 침전 된 폴리머를 유리병에 수집합니다. 중합체를 짜내고 과도한 에탄올을 버린다. 동결 건조라고도 하는 리오필화 공정을 수행하려면, 하룻밤 사이에 침전된 폴리머로 바이알을 영하 80도에서 유지한다.
적어도 48 시간 동안 중합체를 lyophilize. 그런 다음, 건조 된 폴리머를 실온에서 추가 사용까지 저장합니다. 매체를 농축하려면 먼저 표준 조건하에서 시아노박테리아를 재배합니다.
표준 절차를 사용하여 시아노박테리움의 성장을 모니터링합니다. 그런 다음, 원심 분리는 10 분 동안 실온에서 4, 000 배 g에서 배양합니다. 상체를 플라스크로 옮기고 셀 펠릿을 폐기합니다.
다음으로, 0.2미크론 모공 크기 필터를 통해 탈란된 매체를 필터링한다. 배지를 약 500회 농축하려면 원심 4, 000배, 섭씨 15도까지 3킬로달톤의 명목 분자량 컷오프가 있는 원심 농축기를 최대 1시간 원심 분리 라운드에 사용하십시오. 원심분리 후, 필터 장치 샘플 저장소의 벽을 농축 된 샘플로 헹구고 마이크로 원심 분리기 튜브로 함량을 전달합니다.
최대 외프로테아메 회수를 보장하기 위해 오토클레이브 배양 배지를 사용하여 필터 장치 샘플 저장소의 추가 세척 단계를 수행한다. 그런 다음 외음항샘플을 영하 20도에서 추가 사용까지 저장합니다. 에탄올은 중합체 강수량과 수율을 최적화하기 위해 적극적으로 첨가되어야 합니다.
침전된 중합체를 원심분리한 후, 플라스크 벽에 느슨하게 부착될 수 있는 펠릿의 재발을 피하기 위해 상체부의 폐기를 신중하게 해야 한다. 수동 여과가 수행되면 필터 멤브레인을 깨는 것을 피하기 위해 부드럽게해야합니다. 일부 침전 된 폴리머는 시에코시스티스의 EPS의 경우와 같은 플라스크의 벽에 주로 원심 분리 후에만 볼 수 있습니다.
다른 경우에는, 시아노시스 폴리머와 같은, 강수직후 유리 비커에 떠있는 폴리머 덩어리를 볼 수 있다. 일부 오염은 폴리머 색소 침착, 일반적으로 흰색 또는 밝은 갈색을 변화시킬 것이기 때문에 폴리머 lyophilization 후에 매크로로 쉽게 검출될 수 있다. 주황색 폴리머는 카로티노이드 또는 이러한 안료를 포함하는 구조로 오염됩니다.
예를 들어, 녹색 폴리머는 세포 파편과 엽록소로 오염됩니다. 외프로테옴은 세균균에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 단세포 시아노박테리움과 필라멘트 균주에서 외프로테아메를 참조하십시오.
외프로테오메 농축 시료에서 다당류의 양이 많음은 외음류 분석을 저해할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분리를 지연시키고 덜 풍부한 단백질을 마스크할 수 있습니다. 사용자는 조성물, 물리적/화학적 특성, 시험 폴리머 생물학적 활성 또는 변형된 폴리머 성분의 관점에서 폴리머를 특성화할 수 있다.
단백질 식별을 위해 젤 및 질량 분석에서 단백질의 분리를 수행 할 수 있습니다. 그리고 소포의 분리를 위해, 외막의 초원심분리가 수행되어야 한다. 우리 그룹에서, 이러한 프로토콜은 이미 생물학적 제제 또는 항종양 또는 약물 전달 제로서와 같은 다른 분야에서 세포외 탄수화물 폴리머의 시아노균 분비 메커니즘 또는 응용 프로그램을 해명하는 길을 열었습니다.
