이 프로토콜은 세포 외 소포의 좋은 격리및 EBDF 단백질의 더 높은 수의 통지를 보장할 수 있게 합니다. 다른 격리 기술에 비해, 이것은 더 무결성 및 수직 활동임을 유지합니다. LC뿐만 아니라 병리학적 조건에서는 전기자동차가 점점 더 많이 연구되고 있습니다.
이 방법은 우리가 EV를 특성화하고 연구하기로 선택한 모든 시스템에 적용 할 수 있습니다. 이러한 내용이나 생물학적 윤리에 대해 다음과 같은 실험을 통해 배양과 마찬가지로 EV를 반복할 때 특별한 주의가 필요합니다. 시각적 데모는 수제 크기 배제 크로마토그래피 컬럼과 같은 특정 장비뿐만 아니라 나노 입자 카운터 및 질량 분광계의 참여와 같은 특정 장비를 호스팅하는 데 중요합니다.
절차를 입증하는 데 도움이 안토넬라 라포 로메로, 실험실에서 될 것입니다. 조건 배지에서 세포외 소포 또는 EV를 사전 격리하는 것으로 시작합니다. 마이크로글리아 또는 대식세포 배양에서 배양 배지로 조건을 원적 튜브로 옮기고 세포를 펠릿하는 10분 동안 1, 200회 G에서 원심분리기로 옮긴다.
상체를 새로운 원문 튜브와 원심분리기로 20분 간 옮겨 사멸체를 제거합니다. 그런 다음 상체를 10.4 밀리리터 폴리 카보네이트 튜브로 옮킨다. 튜브를 70.1 TI 로터와 초원심분리기의 100배, 000배 G에 넣고 4도에서 90분 동안 전기를 발사합니다.
원심 분리 후, 상체를 버리고 0.2 마이크로미터여과 PBS의 200 마이크로리터에서 펠릿을 재연한다. 전기자동차를 분리하려면 유리 크로마토그래피 컬럼을 세척 및 살균하고 바닥에 60 마이크로리터 필터를 배치하여 수제 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 교차 연결된 아가로즈 젤 여과 베이스 매트릭스로 컬럼을 적층하여 직경 0.6cm, 높이 20cm의 고정 된 위상을 만듭니다.
그런 다음 0.2 마이크로 미터필터링 PBS의 50 밀리리터로 위상을 헹구는 다. 필요한 경우 나중에 사용할 수 있도록 열을 섭씨 4도에 저장합니다. 정지된 EV 펠릿을 고정 된 단계 위에 놓고 고정 된 단계의 상단에 PBS를 계속 추가하면서 250 마이크로 리터의 20 순차 분수를 수집합니다.
분수는 영하 20도에서 저장할 수 있습니다. 나노입자 추적 분석을 수행하려면 0.2 마이크로미터가 여과된 PBS로 각 분획을 희석하고 이를 소용돌이하여 골재를 제거합니다. 솔루션을 1밀리리터 주사기에 넣고 자동 주사기 펌프에 넣습니다.
그런 다음 카메라 설정을 적절한 화면 게인 수준및 카메라 수준으로 조정하고 실행을 클릭합니다. 15초 동안 1000의 주입 속도로 분석 챔버에 샘플을 로드합니다. 그런 다음 비디오 녹화의 속도 흐름을 15초 동안 25로 줄이고 안정화합니다.
파티클 흐름의 3초 연속 60초 동영상을 캡처합니다. 그런 다음 비디오 분석 전에 카메라 수준과 감지 임계값을 조정합니다. 설정을 클릭하여 분석을 시작하고 완료되면 내보내기를 클릭합니다.
각 분수 사이에 0.2 마이크로미터의 1 밀리리터로 시스템을 세척합니다. 전자 현미경 분석을 수행하는 경우 50 킬로달톤 원심 필터를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 분획을 집중시하십시오. 단백질 추출의 경우, 50 마이크로리터의 RIPA 버퍼를 EV 샘플과 5분간 얼음 위에 섞는다.
500와트, 20킬로헤르츠에서 샘플을 5초 동안 세 번 초음파 처리합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 20, 000배 G에서 원심분리하여 정맥투를 제거합니다. 단백질을 분리한 후 12%의 폴리아크릴 젤의 스태킹 젤에서 단백질 이동을 수행합니다.
젤의 단백질을 쿠마시 블루와 20분간 실내 온도에서 섞습니다. 그런 다음 각 컬러 젤 조각을 소비하고 작은 조각으로 자른다. 원고에 설명된 일련의 연속적인 세서스를 통해 젤 조각을 넣습니다.
그런 다음 진공 농축기로 완전히 건조하십시오. 건조 후 100 밀리머라 암모늄 중탄산염 100 마이크로리터로 단백질 감소를 수행하며, 섭씨 56도에서 1시간 동안 10밀리머 디티오트레이톨을 함유하고 있습니다. 다음으로 100 밀리알라 암모늄 중탄산염 100 마이크로리터로 단백질 알킬레이션을 수행하여 어둠 속에서 45분 동안 50밀리알라 요오도아세타미드를 함유하고 있습니다.
원고 의 지시에 따라 젤 조각을 씻고 진공 농축기에서 완전히 건조하십시오. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 20 밀리머암모늄 중탄산염에서 50 마이크로리터의 트립신으로 단백질 소화를 수행합니다. 다음 날, 젤에서 소화된 단백질을 100%ACN 50마이크로리터로 30분간 30분간, 그리고 15분간 실온에서 연속 교반을 합니다.
그런 다음 20 밀리머 암모늄 중탄산염에서 5%TFA의 50 마이크로리터로 단백질을 두 번 추출하고 20 분 동안 지속적으로 저어줍니다. ACN의 마이크로리터 100기를 추가하고 10분 동안 계속 저어줍니다. 그 후, 단백질을 건조하고 0.1 %TFA의 20 마이크로 리터에서 다시 중단.
탈염 및 농축 펩티드를 위한 C 18 역상 매체를 사용한 10 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 샘플을 탈염한다. 그런 다음 ACN과 0.1 %의 포믹 산으로 그들을 엘테하십시오. 진공 농축기로 샘플을 완전히 건조시키고 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 또는 LC-MS용 ACN 20 마이크로리터 및 0.1%포름산으로 재보종합니다.
소화된 펩티드를 기기에 적재하고 시료 분석을 수행한다. EV 절연을 확인하기 위해 각 SCC 분획은 나노입자 추적 분석을 거쳤습니다. 입자 수는 5, 6, 7번분수에서 상당히 높았다.
이러한 분획은 하나의 샘플 2F-EV 양성으로 풀링은 서부 블롯 분석을 사용하여 EV 음수, 1F-EV 음수 및 3F-EV 음수와 비교되었습니다. 결과는 EV 양성 샘플 및 세포 리자테 대조군에서 열 충격 단백질(90)의 존재를 보여주었다. EV 양성 샘플의 전자 현미경 검사는 약 100 나노미터 및 400 나노미터 의 크기 범위에서 전기를 보였다.
프로테오믹스 분석은 EV 음성 샘플에서 오염 물질 단백질을 식별하고 EV의 단백질 함량을 특성화하기 위해 수행되었다. 확인된 단백질은 1F-EV 음성 및 2F-EV 양성 샘플 사이뿐만 아니라 2F-EV 양성 및 3F-EV 음수 샘플 사이에서 비교되었습니다. 이 비표적 방법을 사용하여 536개의 단백질 풀을 ExoCarta 데이터베이스에 제출하고 86개의 EV 관련 단백질의 식별으로 이어졌습니다.
또한,이 풀은 또한 단백질 상호 작용 및 관련 생물학적 기능의 식별을 허용했다. EV 양성 샘플의 단백질이 면역 및 신경 보호 경로에서 역할을 한다는 것을 발견했습니다. microglia 유래 전기 의 효과 PC와 neurite 성장에 평가 되었다 12 세포와 쥐 기본 뉴런.
제어에 비해 전기자동차 하에서 상당한 증가가 관찰되었다. 대식세포 유래 전기는 신경교종 세포 침입에 대해 평가하였다. 그것은 EV가 신경종 스페로이드의 성장과 침략을 손상했다는 것을 것을을 발견되었습니다.
기억해야 할 가장 중요한 것은 이 절차에서 EV의 손실을 방지하기 위해 초원심 분리 단계의 상체를 신중하게 폐기하는 것입니다. 우리는 전체 단백질 함량과 EV의 수직 효과에 초점을 맞추기 위해 대규모 및 비 표적 접근 방식을 선호합니다. 따라서 핵산의 내용은 분석을 사용하여 연관될 수 있다.
1 차적인 문화에서 이 접근을 통해, 우리는 EV 단백질과 다양성의 외부에 있는 자유로운 단백질 사이에서 구별할 수 있습니다. 그래서 문제는이 응고가 관절 인지 또는 오히려 다른 진짜 남아
