이 프로토콜을 사용하면 식민지 유지 비용을 줄이고 진드기 먹이에 필요한 척추 동물의 수를 줄이는 진드기 수를 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜에는 약 20틱이 필요합니다. 그러나 작은 샘플 크기를 사용하는 것 외에 주요 이점은이 프로토콜이 여러 진드기 종 및 다양한 수명 단계에 적용될 수 있다는 것입니다.
진드기 해부 또는 숙주-기생충 상호 작용에 대한 적용 외에도 병원체 감염이 microRNA 분비에 미치는 영향 및 진드기가 분비하는 microRNA에 대한 생리적 변화의 영향. 시작하려면 태아 소 혈청, 트립토스 인산염 액체, 10 % 지단백질 콜레스테롤 농축액, 5 % 중탄산 나트륨, HEPES 및 L15C300 배지를 26.3 밀리리터 폴리 카보네이트 원심 분리기 병에 추가하여 소포가없는 배지를 준비하고 필요에 따라 부피를 조정하십시오. 이제 섭씨 4도에서 100, 000 배 G에서 18 시간 동안 매체를 초 원심 분리합니다.
펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 상청액을 새로운 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 다시 한 번 초원심분리합니다. 상청액을 가져 와서 0.22 마이크로 미터 필터를 통과시켜 오염 물질을 제거하십시오.
상청액을 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 피펫팅하고 필요할 때까지 또는 최대 3 년까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 있는 500마이크로리터의 소포가 없는 배지에 적절한 양의 항생제를 추가합니다. 이제 박테리아 성장을 방지하기 위해 소포가없는 배지가 포함되지 않은 웰에 리팜피신이 함유 된 PBS를 추가하십시오.
해부 현미경으로 양면 카펫 테이프가있는 유리 슬라이드에 진드기를 놓습니다. 해부하기 전에 리팜피신이 함유 된 PBS를 진드기에 넣고 4 밀리미터 Vannas 가위를 사용하여 각 암컷의 측면에 약 1 밀리미터의 절개를하십시오. 이제 진드기의 등쪽과 침샘을 제거한 다음 24웰 조직 배양 처리된 플레이트의 단일 웰에 첨가된 500마이크로리터의 소포가 없는 배지에 20-40개의 진드기 타액선을 넣습니다.
타액선 샘플을 섭씨 32도에서 24시간 동안 배양하여 세포외 소포가 분비될 수 있도록 합니다. 배양이 끝나면 타액선이 포함된 모든 배지를 1.5밀리리터 미세원심분리 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 300배 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
나중에 RNA에 타액선이 들어있는 펠릿을 다시 현탁시키고 사용할 때까지 또는 무기한으로 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이제 상층액을 섭씨 4도에서 2, 000 배 G에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거하고 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 피펫팅합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000 배 G에서 원심 분리하여 세포 사멸체 및 더 큰 세포 외 소포를 제거하고 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 10 밀리리터 주사기에 1 마이크로 미터 나일론 주사기 필터를 조립하고 초 원심 분리기 튜브에 보관하십시오. 그런 다음 샘플을 넣고 주사기에 10 밀리리터의 PBS를 채 웁니다. 상청액을 필터를 통해 튜브로 통과시킵니다.
튜브를 여과하고 균형을 잡은 후 70 Ti 로터에 넣고 섭씨 4도에서 18 시간 동안 튜브를 100, 000 배 G로 초 원심 분리합니다. 농축된 세포외 소포는 초원심분리 후에 펠릿을 형성한다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
피펫팅된 500 마이크로리터의 세포밖 소포를 300 K 원심분리 필터에 넣고 주변 온도에서 10분 동안 8, 000회 G로 원심분리하고 모든 세포밖 소포가 여과될 때까지 이 과정을 반복한다. 마지막으로 멸균된 PBS 400마이크로리터를 컬럼에 넣고 완전히 혼합하여 막에 부착된 세포외 소포를 제거합니다. 그런 다음 샘플을 1.5 밀리리터 DNAase RNAse가없는 튜브에 넣습니다.
세포 외 소포의 농도와 크기는 암컷, 수컷 및 님프의 생물학적 복제 사이에 있는 진드기의 성별과 수명 단계에 따라 다양했습니다. 모든 조합된 생물학적 복제에 대해, 유사한 결과가 관찰되었다. 타액선에서 분리 된 작은 RNA의 분석은 리보솜 RNA 및 마이크로 RNA에 해당하는 밴드를 보였다.
그러나, 리보솜 RNA는 타액선으로부터 분리 된 소포에 존재하지 않았고, 세포 외 소포로부터 정제 된 microRNA 샘플은 더 많은 분해를 보였다. 농축 후, EV로부터 정제된 마이크로RNA 샘플은 cDNA 라이브러리 합성을 위한 최소한의 분해 및 충분한 마이크로RNA 농도를 나타내었다. cDNA 라이브러리 준비가 얻어진 후 약 150 염기쌍의 예상 밴드 크기는 작은 RNA cDNA 라이브러리를 의미합니다.
소포가 없는 준비 중에는 외부 소포 오염을 방지하기 위한 단계를 따르십시오. 웰 플레이트를 준비하는 동안 진드기 마이크로바이옴의 박테리아 오염을 방지하기 위해 항생제를 추가해야 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 추출된 마이크로RNA는 마이크로RNA 경로 표적 예측, 억제 및 모방 실험과 같은 마이크로RNA 역할을 검증하기 위한 프로파일링 및 기능 실험에 사용할 수 있습니다.
