시민 과학자(환자 기증자)의 사례 모집 및 샘플 수집을 지원해 주신 WSU 소동물 내과 서비스(Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT)와 WSU VTH 임상 연구 코디네이터 Valorie Wiss에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, K01OD030515 및 R21OD031903 to Y.M.A.) 소장실과 일본 과학 진흥 협회 젊은 연구자를 위한 해외 챌린지 프로그램(202280196 to I.N.)의 지원을 받았습니다. 그림 1A와 그림 3A는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

Canine IBD Gut-on-a-Chip 시스템에서 3D 형태 형성 확립

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 개의 장 오가노이드와 개의 IBD Gut-on-a-Chip 모델 개발의 호환성을 선구적으로 입증한 것입니다. 장내 오가노이드와 오가노이드 유래 단층 배양을 미세유체 시스템(즉, Gut-on-a-Chip 시스템)에 통합함으로써 기술이 더욱 발전하여 생리학적 역학을 밀접하게 모방하고 생물학적 조건을 더 잘 대표하는 체외 장 모델을 만들 수 있게 되었습니다. 특히, 인간에게 IBD 유래 오가노이드를 사용한 Gut-on-a-Chip 배양에 대한 보고가 거의 없기 때문에, 개 IBD 유래 Gut-on-a-Chip을 사용한 이번 연구는 인간 IBD 연구에 대한 선도적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Gut-on-a-Chip에서 개의 장 상피 3D 형태 형성을 성공적으로 개발하려면 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 첫째, PDMS 미세유체 채널의 소수성 표면은 ECM 접착 및 후속 셀 부착을 방해할 수 있으므로 ECM 코팅 및 셀 파종 전에 PDMS의 표면 활성화가 필요합니다(프로토콜 섹션 1 참조). 안정적인 단층 배양을 달성하려면 세포 부착 후 과도한 미부착 세포를 제거하는 것이 중요합니다(프로토콜 단계 4.6-4.7). 또한 일정한 배지 흐름 및 연동과 같은 진공 운동과 같은 동적 자극은 장 상피의 3D 형태 형성에 필요합니다(프로토콜 단계 5.2). Gut-on-a-Chip 배양의 모든 단계에서 마이크로채널의 기포를 방지하기 위해서는 신중한 취급이 필수적입니다.
Gut-on-a-Chip에 세포 파종이 불량한 경우 세포 수가 적거나 세포 부착이 불량하기 때문일 수 있습니다. 낮은 세포 수 문제를 해결하려면 Matrigel에서 성장을 관찰하여 준비된 장내 오가노이드의 상태를 검사하는 것이 중요합니다. 세포 해리 후 Trypan blue 염색으로 세포 생존율을 평가하여 세포의 20% 이상이 죽지 않도록 할 수 있습니다. 생존 가능한 세포 수가 충분하지 않은 경우 오가노이드 배지 조건을 최적화할 수 있습니다. 또 다른 가능성은 불완전한 오가노이드 해리로, 이로 인해 70μm보다 큰 세포 덩어리가 과도하게 발생하여 필터에 갇히게 됩니다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 옵션은 세포 해리 중 피펫팅 기간을 연장하는 것입니다. 또는 15mL 코니컬 튜브를 트립신 유사 프로테아제로 치료하는 동안 매분마다 부드럽게 교반할 수 있습니다. Gut-on-a-Chip에 대한 세포 부착 불량은 부적절한 ECM 코팅으로 인한 것일 수 있습니다. 코팅 과정에서 기포의 존재 여부를 주의 깊게 확인하고 필요에 따라 코팅 용액을 부드럽게 추가하여 기포 형성을 방지하는 것이 좋습니다. 세포가 과밀화되고 부착되지 않은 세포를 씻어내지 못하면 초기 단층이 불충분해질 수 있습니다. 이 경우 주사기 플런저를 밀 때 약간의 펄스가 가해질 수 있습니다. 이러한 문제 해결 단계는 Gut-on-a-Chip 배양 프로세스 중에 문제를 식별하고 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 Gut-on-a-Chip 플랫폼을 사용하면 물결 모양의 3D 상피층을 생성할 수 있지만, 장내 미세환경을 완전히 복제하기 위해서는 추가적인 생물학적 복잡성이 필요하다는 것을 알고 있습니다. 상피 세포와 중간엽 세포 간의 상호 작용, 3D 재생을 위한 ECM의 증착, 적절한 줄기 세포 틈새를 형성하는 크립트-융모 특성의 존재를 고려하는 것이 중요합니다. 섬유아세포(fibroblast)와 같은 기질 세포는 ECM 단백질의 생산과 장 형태형성(intestinal morphogenesis)의 조절에 중요한 역할을 한다34,35,36. 이 모델에 중간엽 세포를 포함하면 형태 형성과 세포 부착 효율성을 모두 향상시킬 수 있습니다. 모세혈관과 림프관을 포함하는 내피층은 분자 수송과 면역 세포의 모집을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다37,38. 환자 유래 면역 세포의 포함은 선천성 면역과 적응 면역 사이의 상호 작용을 입증하고 조직 특이적 면역을 확립할 수 있기 때문에 장 질환 모델링에 필수적일 수 있습니다39. Gut-on-a-Chip에서 3D 형태 형성이 완료된 후 오가노이드 배양 배지를 오가노이드 분화 배지로 변형할 수 있습니다. 이는 실험 목표에 따라 추가적인 세포 분화를 유도하는 실행 가능한 접근 방식이 될 수 있습니다.
3D 마이크로아키텍처 를 in situ 이미징하는 것은 긴 작동 거리가 필요하기 때문에 까다로우며, 이는 장거리 대물렌즈로 극복할 수 있습니다. 또한 층별 미세 가공 및 접착 방법은 SEM으로 검사하기 위해 상층에 접근하기 어렵게 만듭니다. 현재 Gut-on-a-Chip 설계의 경우 Gut-on-a-Chip 마이크로 장치당 하나의 주사기 펌프가 필요하며, 이는CO2 인큐베이터 공간을 차지하고 대규모 실험을 방지합니다. 사용자 친화적인 플랫폼과 고처리량 스크리닝을 위해 확장성을 높이기 위해서는 혁신이 필요합니다.
이러한 현재 프로토콜은 체외에서 3D 상피층의 자발적인 개발을 가능하게 하여 기존 3D 오가노이드, 2D 단층 및 정적 마이크로디바이스 배양 시스템의 한계를 뛰어넘습니다. 이러한 역동적인 in vitro 장내 미세환경은 다양한 세포 유형의 공동 배양을 도입하여 제어할 수 있습니다. 이전 연구에서는 장내 마이크로바이옴(14,23) 및 말초 단핵 세포(30)를 공동 배양하는 것을 포함하여 Gut-on-a-Chip 미세환경을 조작하는 방법을 탐구했습니다. 이 재구성 된 미세 환경은 약물 테스트, 기초 기계 연구 및 질병 모델링을 포함하여 수많은 잠재적 응용 분야를 가지고 있습니다. 재구성된 미세환경은 약물 검사(23,40,41) 및 질병 모델링(12,13,14,30)과 같은 광범위한 응용뿐만 아니라 장 형태 형성(42)의 근본적인 기계론적 조사에 상당한 잠재력을 가지고 있다. 대사 산물(43)의 평가를 위한 상층액을 수집하거나, 게놈 검사(2,32)를 위한 세포를 수집하거나, 또는 후속 면역형광 이미징(23,44)을 위해 살아있는 세포 염료 또는 고정을 사용하여 세포를 육안으로 검사함으로써 다양한 분석을 수행할 수 있다.
이 연구는 Gut-on-a-Chip 플랫폼에서 개 장 상피층의 3D 형태 형성을 개발하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 그 결과 3D 상피 구조는 장내 미세환경을 보다 사실적으로 표현할 수 있으며, 이는 다양한 생물의학 연구에 응용할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 이 장 구조를 활용함으로써 우리는 더 많은 중개 연구를 수행하고 잠재적으로 유망한 결과를 얻을 수 있습니다.

장 상피 형태 형성은 주로 실험 동물 모델을 통해 연구되어 왔는데, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 인간 발달 과정을 정확하게 나타내지 못합니다1. 또한, 기존의 정적 2D 세포 배양 모델은 3D 상피 구조의 복잡한 공간 구성을 모방할 수 있는 능력이 부족하다2. 그 결과, 장 상피 구조에 대한 이해를 높이기 위해 인간 관련 동물 모델의 장 상피 세포를 사용하여 in vitro 3D 형태 형성을 유도하는 프로토콜이 필요합니다.
반려견은 가축화 과정에서 환경과 식단을 공유하기 때문에 인간과 매우 유사한 장내 해부학적 구조와 마이크로바이옴 구성을 발달시켰다3. 이러한 유사성 외에도 인간과 개는 장 건강에 기인하는 것으로 생각되는 다양한 만성 질환을 공유합니다. 개는 인간과 마찬가지로 비만, 인지 기능 장애, 당뇨병, 염증성 장 질환(IBD) 및 결장직장 선암과 같은 만성 질환이 자발적으로 발생할 수 있습니다 4,5,6,7,8,9,10. 이전의 Gut-on-a-Chip 연구 2,11,12,13,14에서 인간과 쥐 상피 세포의 개발 및 사용에도 불구하고 개 장 상피는 지금까지 활용되지 않았습니다. 3D 상피 형태 형성이 있는 동적 배양 시스템에서 개의 장 오가노이드 상피를 활용하는 당사의 새로운 접근 방식은 개와 인간 의학 모두에 중요한 영향을 미칩니다.
최근 장내 오가노이드 배양의 발전으로 개의 장 오가노이드 배양이 확립되었다15. 이 배양 시스템은 정의된 모르포겐 컨디셔닝 하에서 장 줄기세포를 배양하는 것을 포함하며, 그 결과 성체 줄기 세포로부터 유래된 자가 재생 특성을 갖는 3D 모델이 생성된다16. 그러나, 수송 분석 또는 숙주-마이크로바이옴 공동 배양을 수행하는 것은 장 내강(intestal lumen)의 밀폐된 특성 때문에 이 3D 모델에 어려움을 야기한다17. 이를 해결하기 위해 연구원들은 장 오가노이드에서 파생된 2D 단층을 생성하여 발광 표면18,19의 노출을 허용했습니다. 그러나 3D 오가노이드와 2D 단층 모두 정적인 조건에서 유지되기 때문에 장내 미세환경의 생체 내 생체 역학을 정확하게 반영하지 못합니다. 환자 유래 반려견 오가노이드 기술과 체외 3D 형태 형성을 결합하면 만성 다인자 질환에 대한 중개 연구의 기회를 얻을 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 연구자들은 인간과 개 모두에게 도움이 되는 보다 효과적인 치료법을 개발하고 인간, 동물 및 환경 건강의 상호 연결성을 인식하는 협력 접근 방식인 One Health Initiative에 따라 중개 연구를 더욱 발전시킬 수 있습니다. 복잡한 건강 문제를 해결하고 모두를 위한 최적의 건강 결과를 달성하기 위해 학제 간 협력을 촉진합니다. 이 이니셔티브는 인간, 동물 및 생태계 간의 상호 의존성을 이해함으로써 신종 전염병, 환경 악화 및 기타 공통된 건강 문제로 인한 위험을 완화하는 것을 목표로 합니다20,21,22.
이 프로토콜은 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 다공성 멤브레인이 있는 Gut-on-a-Chip 마이크로디바이스에서 환자 오가노이드에서 얻은 개의 장 상피 세포를 배양하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 개의 장 오가노이드와 이 Gut-on-a-Chip 기술을 통합하여 3D 상피 형태 형성을 확립함으로써 장이 세포 조직과 줄기 세포 틈새를 어떻게 발달하고 유지하는지 연구할 수 있습니다. 이 플랫폼은 마이크로바이옴 군집이 장 건강에 미치는 영향을 조사하고 이러한 군집이 장 병태생리학에 기여하는 미생물 대사 산물을 생성하는 방법을 이해할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다14,23. 이러한 발전은 이제 개의 장 샘플로 확장되어 연구자들에게 장내 마이크로바이옴과 숙주 생리학 사이의 복잡한 관계를 탐구할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 이를 통해 장 병태생리학의 기본 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻고 개와 인간의 건강뿐만 아니라 다양한 질병 상태에서 미생물 대사 산물의 잠재적 역할을 이해할 수 있는 길이 열립니다. 개 Gut-on-a-Chip에 사용되는 프로토콜은 재현성이 뛰어나 이 접근법을 통해 개와 사람 모두에서 숙주-마이크로바이옴 상호 작용, 병원체 감염 및 프로바이오틱스 기반 치료 효과를 조사할 수 있으므로 비교 의학에 적합한 실험 모델입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM, glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30009CI</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids and organoid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>9094360</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td>2.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells engineered to secrete Noggin&#160;</td>
			<td>Baylor College of Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 MAX Media supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>10% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 (Rspo1) cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Rspo1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1 Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td>&#160;10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>StemCellTechnologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15 ]-Gastrin I human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td>x250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG H&#38;L labeled with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>x50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 50%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408700-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>87V Industrial Multimeter</td>
			<td>Fluke Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C170i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-103-0519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexCell FX-5000 Tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>SP8-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>model no. BS-8000 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/ozone generator</td>
			<td>Jelight Company</td>
			<td>model no. 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X imaging software&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional morphogenesis in canine gut-on-a-chip using intestinal organoids derived from inflammatory bowel disease patients

개의 장은 해부학, 미생물학, 생리학적으로 인간과 유사하며, 개는 자연적으로 인간과 유사한 자발적 장 질환을 앓게 됩니다. 장 상피의 정점 표면에 접근하는 데 있어 3차원(3D) 오가노이드의 고유한 한계를 극복하기 위해 오가노이드에서 파생된 세포를 사용하여 접근 가능한 내강 표면을 노출하는 2차원(2D) 단층 배양이 생성되었습니다. 이러한 오가노이드와 오가노이드 유래 단층 배양을 미세유체 Gut-on-a-Chip 시스템에 통합함으로써 기술이 더욱 발전하여 생리학적으로 더 관련성이 높은 동적 in vitro 장 모델을 개발할 수 있게 되었습니다.
이 연구에서는 염증성 장 질환(IBD)에 걸린 개에서 얻은 1차 장 조직 샘플을 사용하여 개 장 상피의 3D 형태 형성을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 3D 장 오가노이드에서 파생된 세포를 사용하여 2D 단층 배양 및 장-온-a-칩 시스템을 생성하고 유지하기 위한 프로토콜에 대해서도 설명합니다. 이 연구에서 제시된 프로토콜은 반려견을 위해 특별히 설계된 미세유체 Gut-on-a-Chip 시스템을 구축하기 위한 기본 프레임워크 역할을 합니다. 이 혁신적인 접근 방식의 토대를 마련함으로써 우리는 One Health Initiative의 원칙에 따라 생물 의학 및 중개 연구에서 이러한 기술의 적용을 확대하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법을 활용함으로써 우리는 개와 인간 모두의 장 생리학을 연구하기 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 동적 체외 모델을 개발할 수 있습니다. 이는 두 종 모두에서 장 질환에 대한 보다 효과적인 치료법 개발에 도움이 될 수 있기 때문에 생물 의학 및 제약 응용 분야에 중요한 영향을 미칩니다.

Intestinal epithelial morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time-consuming, and do not accurately represent human developmental processes1. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D epithelial architecture2. As a result, there is a need for a protocol to induce in vitro 3D morphogenesis using intestinal epithelial cells from human-relevant animal models to advance our understanding of gut epithelial architecture.
Companion dogs have developed intestinal anatomy and microbiome compositions that are remarkably similar to humans due to their shared environment and diet during domestication3. In addition to this similarity, both humans and dogs share various chronic morbidities that are thought to be attributed to intestinal health. Dogs, like humans, can spontaneously develop chronic conditions such as obesity, cognitive dysfunction, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease (IBD), and colorectal adenocarcinoma4,5,6,7,8,9,10. Despite the development and use of human and murine epithelial cells in previous Gut-on-a-Chip studies2,11,12,13,14, canine intestinal epithelium has not been utilized until now. Our novel approach, utilizing canine intestinal organoid epithelium in a dynamic culture system with a 3D epithelial morphogenesis, has significant implications for both canine and human medicine.
Recent advancements in intestinal organoid culture have led to the establishment of canine intestinal organoid culture15. This culture system involves culturing intestinal stem cells under defined morphogen conditioning, resulting in a 3D model with self-renewing properties derived from adult stem cells16. However, conducting transport assays or host-microbiome cocultures poses difficulties with this 3D model because of the enclosed nature of the intestinal lumen17. To address this, researchers have generated a 2D monolayer derived from intestinal organoids, allowing for exposure of the luminal surface18,19. However, both 3D organoids and 2D monolayers are maintained under static conditions, which do not accurately reflect the in vivo biomechanics of the intestinal microenvironment. Combining patient-derived canine organoids technology with in vitro 3D morphogenesis presents an opportunity for translational research into chronic multifactorial diseases. This approach enables researchers to develop more effective treatments benefiting both humans and dogs and further advance translational research, aligning with the One Health Initiative, which is a collaborative approach that recognizes the interconnectedness of human, animal, and environmental health. It promotes interdisciplinary cooperation to address complex health challenges and achieve optimal health outcomes for all. By understanding the interdependencies between humans, animals, and ecosystems, the initiative aims to mitigate risks from emerging infectious diseases, environmental degradation, and other shared health concerns20,21,22.
This protocol outlines comprehensive methods for culturing canine intestinal epithelial cells obtained from patient organoids on a Gut-on-a-Chip microdevice with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membrane. Establishing the 3D epithelial morphogenesis by integrating canine intestinal organoids and this Gut-on-a-Chip technology enables us to study how the gut develops and maintains its cellular organization and stem cell niche. This platform offers a valuable opportunity to investigate the impact of microbiome communities on gut health and understand how these communities generate microbial metabolites that contribute to intestinal pathophysiology14,23. These advancements can now be extended to canine intestinal samples, providing researchers with opportunities to explore the intricate relationship between the gut microbiome and host physiology. This opens up avenues for gaining valuable insights into the underlying mechanisms of intestinal pathophysiology and understanding the potential role of microbial metabolites in both canine and human health, as well as various disease conditions. The protocol used for canine Gut-on-a-Chip is reproducible, making it a suitable experimental model for comparative medicine, as this approach enables investigation of host-microbiome interactions, pathogen infections, and probiotic-based therapeutic effects in both dogs and humans.

저자 스포트라이트: 3D 장 형태 형성 연구를 위한 개 IBD Gut-on-a-Chip 모델의 개발 및 적용 

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

Our research goal is to create a method for growing 3D structures using intestinal cells from animals similar to humans, specifically dogs. Intestinal cellular morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time consuming, and do not accurately represent human developmental processes. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D abSerial architecture.Achieving the attachment of individual cells derived from intestinal organoids onto the ECM-coated PDMS surface has posed a significant challenge. A pivotal step in addressing this challenge in both ensuring a uniform ECM coating through surface activation and allowing it to dry overnight. The integration of patient-derived canine organoid technology with in-vitro 3D Morphogenesis offers a promising avenue for conducting translational research into chronic multifactorial diseases, aligning with the One Health Initiative.The protocol for canine IBD, got on a chip, offers a replicable model for comparative medicine, enabling studies on intestinal morphogenesis, host-microbiome interactions, infections, drug and probiotic screenings, and has cross-species applicability.

이 프로토콜은 Gut-on-a-Chip 시스템에서 3D 장 형태 형성의 자발적인 발달을 안정적으로 촉진합니다. 이 접근법은 염증성 장 질환(IBD)에 걸린 개에서 유래한 장 오가노이드에서 얻은 개의 장 상피 세포를 활용합니다(그림 1B). 개 장 상피 세포의 3D 형태 형성의 간헐적인 클러스터링은 6-9일의 중간 흐름 후 마이크로채널 전체에서 관찰될 수 있습니다(그림 3C). 이러한 형태학적 변화는 위상차 기술을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 이 연구에서는 IBD 진단을 받은 두 마리의 개에서 추출한 오가노이드를 활용했습니다. 특히, 성공적인 3D 형태 형성은 두 개의 생물학적 복제에서 관찰되었으며, 각 복제는 두 개의 기술적 복제로 수행되었습니다. 이 연구의 결과는 다른 개 기증자로부터 유래한 장내 오가노이드와 관련된 향후 연구를 위한 기초를 제공합니다. 이러한 결과는 이전에 인간 샘플에서 보고된 실험적 접근 방식의 잠재적인 적용 가능성과 반복성을 보여줍니다. 이러한 발견은 Gut-on-a-Chip 기술이 이전에 인간의 장 상피 세포를 활용한 연구에서 보고된 바와 같이 개의 장 상피 세포에 적용할 수 있음을 추가로 확인시켜 줍니다2.
이 프로토콜은 기존의 형광 현미경을 사용하여 미세유체 칩에서 융모와 같은 구조를 형성한 오가노이드 유래 단층의 3D 구조를 평가하는 데 면역형광 염색을 사용할 수 있음을 보여주었습니다(그림 4 A,B). 이 프로토콜은 면역형광 염색을 통해 분화되고 공간적으로 조직화된 세포 표현형을 검증하도록 조정할 수 있습니다. Gut-on-a-Chip 내에서 3D 형태 형성의 시각화는 다양한 병리학적 상호작용 동안 숙주 반응을 조사할 수 있는 훌륭한 기회를 제공한다 14,23,31. 이전에 인간에서 기술된 바와 같이, 환자 기증자로부터 유래한 상피세포와 결합될 때, 이 기술은 장 질환의 개인화된 모델을 구축하는데 이용될 수 있다13. 형광 in situ hybridization과 같은 표적 RNA 시각화 기술과 면역형광 이미징의 통합을 통해 Gut-on-a-Chip 시스템 내에서 숙주의 전사체 및 단백질체를 시각적으로 분석할 수 있습니다.
장막의 무결성을 보존하는 것은 장 항상성을 유지하는 데 매우 중요하며, Gut-on-a-Chip 플랫폼은 이 중요한 기능을 정밀하게 모니터링하고 정량화할 수 있어 귀중한 이점을 제공합니다. Gut-on-a-Chip 기술을 사용한 TEER 측정은 몇 가지 이점을 제공합니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 장 세포를 비병원성 및 프로바이오틱 박테리아(32)와 함께 공동 배양하는 동안, 그리고 장누수성 조건(leaky-gut-condition)에서 TEER을 성공적으로 평가했다23. 이를 통해 연구자들은 다양한 질환이 장 장벽 기능에 미치는 영향을 연구하고 장 건강을 증진하기 위한 잠재적인 개입을 식별할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig01.jpg"> 그림 1: 환자 유래 반려견 IBD Gut-on-a-Chip의 확립. (A) 환자 유래 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 플랫폼의 통합. 내시경 생검을 통해 장 크립트 세포를 분리하여 기증자 특이적 장 오가노이드를 개발할 수 있습니다. 상피 세포는 오가노이드에서 단일 세포로 해리된 다음 PDMS 기반 Gut-on-a-Chip에 파종하고 고유한 동적 미세환경에서 배양할 수 있습니다. (B) IBD 개의 콜로노이드 대표 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (C) 이 회로도는 상부 및 하부 마이크로 채널 사이에 배치된 다공성 멤브레인으로 구성된 Gut-on-a-Chip 장치를 보여줍니다. 위쪽 마이크로 채널은 파란색 영역으로 표시되고 아래쪽 마이크로 채널은 빨간색 영역으로 표시됩니다. 진공 챔버는 마이크로 채널의 각 측면에 존재하며, 이는 다공성 막을 변형시켜 연동 운동(24)을 모방한다. (D) 송곳니 Gut-on-a-Chip의 설정에는 커버 슬립(2,24) 상에 배치되는 튜빙으로 조립된 PDMS 기반 Gut-on-a-Chip이 포함됩니다. 바이패스 튜빙은 취급(예: 주사기에 연결) 중에 마이크로채널 내에 압력이 축적되는 것을 방지하는 데 중요합니다. 바인더 클립은 튜브를 고정하는 데 사용됩니다. 부피에 민감한 물질은 상부 또는 하부 배출구의 열린 구멍을 통해 주입할 수 있습니다. 오가노이드 배양 배지는 주사기를 뭉툭한 끝 바늘에 연결하고 상부 및 하부 입구를 통해 흐르게 하여 주입할 수 있습니다. 약어: IBD = inflammatory bowel disease; PDMS = 폴리디메틸실록산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig02.jpg"> 그림 2: 개 IBD Gut-on-a-Chip의 융모 유사 구조 형성. 해리된 상피 세포를 ECM으로 코팅된 Gut-on-a-Chip에 파종했습니다. 해리된 세포가 PDMS 멤브레인에 부착되면 3일(D0-D3) 동안 정점 흐름이 시작되었습니다. 합류 2D 단층이 형성되면(D3) 빈번한 스트레칭을 동반한 기저변 흐름이 시작됩니다(스트레칭, AP 및 BL 흐름). 2-3일의 이중 흐름 및 막 스트레칭 후 2D 단층은 3D 형태 형성을 시작하고 9일 배양 후 융모와 같은 구조가 형성됩니다(3D 형태 형성, D9-D12). 약어: ECM = 세포외 기질; PDMS = 폴리디메틸실록산; AP = 정점; BL = 기저변. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig03.jpg"> 그림 3: Gut-on-a-Chip의 개 장 오가노이드 파종 및 3D 형태 형성. (A) PDMS 기반 Gut-on-a-Chip에서 다공성 막의 표면 활성화를 위한 실험 단계. UV/오존 처리, PEI 및 GA 처리를 함께 사용하면 ECM 용액에 존재하는 아민의 가교가 촉진됩니다. 이 과정은 ECM 단백질을 다공성 막에 안정적으로 고정시킵니다. (B) 위상차 이미지는 파종 직후(왼쪽)와 파종 후 3-5시간(오른쪽)의 세포 형태를 보여줍니다. 파종 3시간 후 다공성 막은 단일 세포가 부착된 더 얇고 어두운 영역을 표시하여 부착 과정을 강조합니다. (C) 위상차 이미지는 Gut-on-a-Chip 시스템 내에서 장 단층의 3D 형태 형성을 묘사합니다. 이 단층은 IBD에 걸린 개에서 유래했으며 이러한 오가노이드 세포는 유체 흐름 및 스트레칭 동작을 포함하는 동적 조건에서 12일 동안 배양되었습니다. 척도 막대 = 50μm(B,C). 약어: IBD = inflammatory bowel disease; ECM = 세포외 기질; PDMS = 폴리디메틸실록산; PEI = 폴리에틸렌민; GA = 글루타르알데히드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig04.jpg"> 그림 4: 환자 유래 송곳니 Gut-on-a-Chip의 3D 형태학적 발달 평가. (A) 송곳니 IBD Gut-on-a-Chip의 면역형광 이미징, 형광 현미경으로 평가한 12일 배양 후 완전히 발달된 3D 상피의 하향식 보기를 보여줍니다. 밀착 접합 단백질(ZO-1)은 노란색으로 시각화됩니다. 브러시 테두리 막(F-actin)은 빨간색으로 나타납니다. 핵은 DAPI로 염색되어 파란색으로 나타납니다. (B) 장거리 렌즈가 장착된 컨포칼 현미경을 사용한 개 IBD Gut-on-a-Chip의 면역형광 이미징. 개략도에서 볼 수 있듯이 12일간의 배양 후 완전히 발달된 3D 상피의 융모와 같은 구조의 단면에 대한 형광 이미지가 표시됩니다. 또한 Z-스태킹은 3D 상피의 측면도를 보여주며, 이는 융모와 같은 구조의 형성을 보여줍니다. 브러시 경계막(F-actin)은 빨간색으로 나타나고 핵은 DAPI로 염색되어 파란색으로 나타납니다. (C) 장 장벽 기능은 환자 유래 개 Gut-on-a-Chips에서 TEER에 의해 평가 및 측정되었습니다. 안정적인 TEER 값은 Gut-on-a-Chip에서 배양 5일차에 도달했습니다. 오차 막대는 측정값의 SEM을 나타냅니다. TEER 값은 하나의 기술적 복제와 함께 두 개의 생물학적 복제물 사이에서 측정되었습니다. 스케일 바 = 50 μm(A), 25 μm(B). 약어: IBD = inflammatory bowel disease; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; TEER = 경상피 전기 저항. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 개 대장 유래 단층 및 Gut-on-a-Chip 장치에서 항-ZO-1 다클론 항체의 특성화. (A) 노란색의 ZO-1과 빨간색의 F-actin의 면역형광 염색 및 오버레이 이미지. 눈금 막대 = 25μm. (B) 'Leaky Gut Chips'에서 노란색으로 표시된 ZO-1의 면역형광 시각화는 프로바이오틱 박테리아(LGG + Cytokines 또는 VSL#3 + Cytokines)를 사용한 자극 및 프로바이오틱스 자극을 사용하지 않은 무균 대조군(Cytokines)을 포함한 다양한 조건에서 수행되었습니다. 눈금 막대 = 50μm. 이 그림은 Min et al.23에서 재현되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/FigureS1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S1: 조직 기증자 정보 요약. 기증자의 연령, 성별, 품종, 조직병리학적 평가 및 개 IBD 활동 지수(CIBDAI) 점수의 요약표. CIBDAI는 개 IBD33의 임상적 중증도를 추론하는 데 사용되는 수치 채점 시스템입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720_SupplementTable.JoVE.Nagao%20(2).xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

우리의 연구 목표는 인간과 유사한 동물, 특히 개의 장 세포를 사용하여 3D 구조를 성장시키는 방법을 만드는 것입니다. 장 세포 형태 형성은 주로 실험실 동물 모델을 통해 연구되어 왔는데, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 인간 발달 과정을 정확하게 나타내지 않습니다. 또한 기존의 정적 2D 세포 배양 모델은 3D abSerial 아키텍처의 복잡한 공간 구성을 모방할 수 있는 기능이 부족합니다.장 오가노이드에서 유래한 개별 세포를 ECM 코팅 PDMS 표면에 부착하는 것은 상당한 도전 과제였습니다. 표면 활성화를 통해 균일한 ECM 코팅을 보장하고 밤새 건조되도록 하는 이 문제를 해결하는 데 있어 중추적인 단계입니다. 환자 유래 개 오가노이드 기술과 체외 3D 형태 형성의 통합은 One Health Initiative에 따라 만성 다인자 질환에 대한 중개 연구를 수행할 수 있는 유망한 길을 제공합니다.개 IBD에 대한 프로토콜은 칩에 탑재되어 비교 의학을 위한 복제 가능한 모델을 제공하여 장 형태 형성, 숙주-마이크로바이옴 상호 작용, 감염, 약물 및 프로바이오틱스 스크리닝에 대한 연구를 가능하게 하고 종 간 적용 가능성을 가지고 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

2.0K 조회수.  Washington State University. 우리의 연구 목표는 인간과 유사한 동물, 특히 개의 장 세포를 사용하여 3D 구조를 성장시키는 방법을 만드는 것입니다. 장 세포 형태 형성은 주로 실험실 동물 모델을 통해 연구되어 왔는데, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 인간 발달 과정을 정확하게 나타내지 않습니다. 또한 기존의 정적 2D 세포 배양 모델은 3D abSerial 아키텍처의 복잡한 공간 구성을 모방할 수 있...

비디오: 저자 스포트라이트: 3D 장 형태 형성 연구를 위한 개 IBD Gut-on-a-Chip 모델의 개발 및 적용 

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal disorders similar to humans. Overcoming the inherent limitation of three-dimensional (3D) organoids in accessing the apical surface of the intestinal epithelium has led to the generation of two-dimensional (2D) monolayer cultures, which expose the accessible luminal surface using cells derived from the organoids. The integration of these organoids and organoid-derived monolayer cultures into a microfluidic Gut-on-a-Chip system has further evolved the technology, allowing for the development of more physiologically relevant dynamic in vitro intestinal models.
In this study, we present a protocol for generating 3D morphogenesis of canine intestinal epithelium using primary intestinal tissue samples obtained from dogs affected by inflammatory bowel disease (IBD). We also outline a protocol for generating and maintaining 2D monolayer cultures and intestine-on-a-chip systems using cells derived from the 3D intestinal organoids. The protocols presented in this study serve as a foundational framework for establishing a microfluidic Gut-on-a-Chip system specifically designed for canines. By laying the groundwork for this innovative approach, we aim to expand the application of these techniques in biomedical and translational research, aligning with the principles of the One Health Initiative. By utilizing this approach, we can develop more physiologically relevant dynamic in vitro models for studying intestinal physiology in both dogs and humans. This has significant implications for biomedical and pharmaceutical applications, as it can aid in the development of more effective treatments for intestinal diseases in both species.

Integration of canine intestinal organoids and a Gut-on-a-Chip microfluidic system offers relevant translational models for human intestinal diseases. Protocols presented allow for 3D morphogenesis and dynamic in vitro modeling of the gut, aiding in the development of effective treatments for intestinal diseases in dogs and humans with One Health.