이 프로토콜은 사용자를 돕고 학생들에게 BMA, AEG 및 2, 4-DAB 추출의 올바른 단계를 가르칩니다. 따라서 오류 가능성을 최소화하고 일관된 결과를 생성합니다. 이 방법은 사우나 박테리아 매트릭스에서 BMA 및 그 이성질체 AEG 및 2, 4-DAB의 추출에 일반적으로 사용되고 검증 된 방법입니다.
이 방법은 BMA 독성에 관한 추가 연구에 활용되고 BMA 및 관련 건강 영향에 대한 더 큰 이해를 제공합니다. 시아 노 박테리아 샘플을 섭씨 25도에서 10 분 동안 3, 500G에서 원심 융합하여 시작하십시오. 및 상청액을 생물학적 폐기물로 폐기한다.
펠릿이 들어있는 원심 분리 튜브를 밀봉 필름으로 덮고 날카로운 긴 노즈 핀셋을 사용하여 필름에 몇 개의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 영하 80도에서 똑바로 세우십시오. 30분 후 튜브를 동결 건조기 유리 용기에 똑바로 세우고 용기를 섭씨 영하 80도의 냉동고 안에 5분 동안 넣어 냉각시킵니다.
냉동실에서 유리 용기를 꺼내 고무 뚜껑을 부착하십시오. 동결 건조기의 고무 밸브 배출구에 있는 손잡이가 위쪽을 향하고 대기로 배출되는지 확인하십시오. 유리 용기를 단단히 부착하십시오.
고무 밸브 배출구의 손잡이를 천천히 돌려 아래쪽 위치를 향하게하여 용기를 진공에 노출시킵니다. 그리고 모든 액체를 승화시키기 위해 최대 24시간의 동결 건조를 허용합니다. 완료되면 15-50 밀리그램의 냉동 샘플 펠릿을 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 넣습니다.
분석 저울 사용. 샘플에 300 내지 600 마이크로리터의 10% 수성 트리클로로아세트산 또는 TCA를 첨가한다. 분쇄 된 얼음으로 채워진 용기에 샘플 튜브를 놓습니다.
프로브의 끝을 샘플에 완전히 담그고 시작을 누르기 전에 70% 에탄올이 뿌려진 보푸라기가없는 종이 와이프로 초음파 처리기 프로브를 닦습니다. 완료되면 원심분리 튜브가 포함된 샘플을 얼음 위에 1분 동안 놓습니다. 그리고 세포 용해를 보장하기 위해 초음파 처리 과정을 반복하십시오.
샘플을 섭씨 4도에서 24시간 동안 냉각시킨 후. 섭씨 8도에서 15 분 동안 3, 500G에서 원심 분리기. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 상청액을 유리 분획으로 표시된 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
400 마이크로 리터의 10 % 수성 TCA를 샘플 펠릿에 추가하고 와류 교반 또는 마이크로 피펫 팁으로 펠릿을 분해합니다. 원심분리하여 상청액을 동일한 2밀리리터 유리 분획 튜브로 옮깁니다. 10 % TCA 아세톤을 사용하여이 단계를 세 번 반복하십시오.
모든 휘발성 액체가 제거 될 때까지 뚜껑이 열린 상태에서 자유 분획 튜브를 원심 증발기에 넣습니다. 샘플에 휘발성 액체가 없으면 튜브를 천장 필름으로 단단히 덮고 날카로운 긴 노즈 핀셋을 사용하여 몇 개의 구멍으로 필름을 뚫습니다. 이전에 입증 된 동결 건조 후, 샘플을 200 마이크로 리터의 20 밀리몰 염산으로 재구성하고 섭씨 영하 80 도의 냉동고에 넣습니다.
마이크로 피펫을 사용하여 샘플 펠릿에 400 마이크로 리터의 100 % 아세톤을 추가하고 와류 교반 또는 마이크로 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 분해합니다. 세척되고 재현탁된 펠릿을 해당 유리 쉘 바이알에 정량적으로 옮깁니다. 1 밀리리터 마이크로 피펫을 사용합니다.
나머지 펠릿을 옮기는 데 도움이 되도록 샘플 튜브에 400마이크로리터의 아세톤을 더 추가합니다. 액체가 제거되고 펠릿이 건조될 때까지 원심 증발기에서 펠릿을 건조하기 전에 상청액 액체를 생물학적 폐기물로 원심분리하고 디캔트합니다. 진공 가수 분해 파일을 준비하려면 6 몰 염산 1 밀리리터를 가수 분해 파일의 바닥에 첨가하십시오.
건조된 샘플이 있는 라벨이 붙은 쉘 바이알을 핀셋을 사용하여 가수분해 파일에 조심스럽게 삽입하여 똑바로 세워 놓은 안정적인 위치를 보장합니다. 뚜껑을 가수 분해 파일에 부착하고 뚜껑의 빨간색 손잡이를 눌러 밸브를 닫습니다. 진공 펌프를 켠 후 진공관을 가수분해 파일 뚜껑의 헤드에 부착하고 뚜껑의 녹색 손잡이를 눌러 밸브를 엽니다.
다음으로, 진공 펌프가 바이알에서 공기를 1분 동안 제거하도록 합니다. 그런 다음 가수분해 바이알 뚜껑의 빨간색 손잡이를 눌러 바이알을 닫습니다. 진공 펌프를 끄고 진공관을 제거하십시오.
실험실 벤치의 질소 가스 탭에 고무 튜브를 부착합니다. 그리고 탭을 약간 엽니 다. 엄지 손가락을 튜브 끝에 놓고 밀봉 한 다음 압력이 쌓이면서 가스가 빠져 나가기 시작할 때까지 세십시오.
다음으로 고무 튜브의 다른 쪽 끝을 가수 분해 바이알 뚜껑의 머리에 부착합니다. 그리고 즉시 뚜껑의 녹색 손잡이를 밉니다. 가스가 빠져 나가는 데 걸리는 시간을 세십시오.
뚜껑의 빨간색 손잡이를 빠르게 밀고 고무 튜브를 제거합니다. 전체 진공 처리 과정을 두 번 반복하십시오. 유리 가수 분해 바이알에 공기가없고 질소 가스로 채워져 있는지 확인합니다.
가수분해 바이알을 섭씨 110도로 예열된 오븐에 16-18시간 동안 넣습니다. 오븐 장갑을 사용하여 오븐에서 유리 가수분해 바이알을 꺼냅니다. 바이알을 흄 후드 내부에서 10분 동안 식힌 후 녹색 손잡이를 멀리 향하게 하여 밀어 압력과 가스를 방출합니다.
가수분해된 샘플 펠릿을 200마이크로리터의 20몰 염산으로 쉘 바이알에 재구성하고 펠릿을 재현탁합니다. 재구성된 샘플 펠릿이 들어 있는 쉘 바이알을 섭씨 5도, 300G 및 섭씨 25도에서 2분 동안 원심분리합니다. 재구성된 유리 분획 샘플과 단백질 분획을 0.2미크론 공극 멤브레인 필터가 포함된 2개의 밀리리터 필터 튜브에 옮기고 유리 분획 및 단백질 분획으로 표지합니다.
원심 분리를 위해 튜브를 5, 000 G 및 섭씨 25도에서 30 분 동안 놓습니다. 베타 - 메틸 아미노 -L- 알라닌 또는 BMAA 및 그 이성질체를 포함하는 표준물질의 다중 반응 모니터링 크로마토 그램이 여기에 표시됩니다. 세 가지 이성질체 인 BMAA, DAB 및 AEG 모두에 대한 양성 검출은 Liddel 호수에서 수집 된 Merismopedia 종의 유리 분획에서 관찰되었습니다.
와카 상수도에서 수집 한 Microcystis flos-aquae 종의 결합 분획은 BMAA와 그 이성질체에 대해 부정적인 결과를 나타 냈습니다. 재현탁된 펠릿은 시아노박테리아 질량을 기반으로 정확한 정규화 지점을 허용하기 위해 해당 쉘 바이알로 정량적으로 옮겨야 합니다. 이 단계를 수행하는 동안 환자와 실사가 권장됩니다.
이 절차를 따릅니다. 추출 된 분획은 역상을 허용하기 위해 활성화 단계를 거쳐야합니다. 액체 크로마토 그래피, 탠덤 질량 분석.
이 기술의 적용은 다양한 과학 분야를 확장합니다. 환경 샘플에서 시노 톡신 분석을 통한 환경 과학을 포함합니다. 그리고 BMA의 잘못된 편입 이론의 조사를 통한 독성학 및 생화학과 같은 분야.
