이 프로토콜은 친화성 클린업 및 단백질 단백질 분해를 위해 비드를 준비하는 방법과 건조된 미세 샘플에서 소농도 단백질을 측정하는 데 이를 사용하는 방법에 대한 단계별 개요를 제공합니다. 가장 큰 장점은 매우 적은 양의 복잡한 시료를 매우 효율적으로 샘플링하여 준비하고 수행할 수 있는 도구가 제공된다는 것입니다. 이 방법은 단백질 또는 단백질형 펩티드 중 하나를 포획하기 위한 효율적인 항체에 접근할 수 있는 한 다른 단백질 바이오마커에 적용할 수 있습니다.
항체의 산 처리를 위해 pH를 조절할 때, 특히 소량의 비드를 준비하는 경우 매우 주의해야 합니다. 시작하려면 원하는 부피의 항체 용액을 5밀리리터의 저단백질 결합 미세 원심분리 튜브로 옮기고 항체 용액에 작은 자석 교반 막대를 추가합니다. 미세 전극이 있는 pH 측정기를 사용하여 pH를 측정하고 먼저 10μL의 1몰 염산을 추가한 다음 pH가 2.5에 가까워지면 부피를 줄여 pH를 조정합니다.
pH를 2.5로 조정하는 데 필요한 1몰 염산의 총 부피를 기록합니다. 미세전극을 제거하고, 산성화된 항체를 얼음 위에서, 자석 교반기 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 항체 용액을 중화하기 위해, pH를 측정하고, 먼저 10 마이크로리터의 1몰 수산화나트륨을 첨가한 다음, pH가 7에 가까워짐에 따라 수산화나트륨의 부피를 감소시켜 pH를 7로 조정한다.
첨가된 1몰 수산화나트륨의 총 부피를 기록합니다. 마그네틱 비드 현탁액을 볼텍스 믹서에서 완전히 혼합하고 원하는 양의 비드 현탁액을 포함하는 부피를 빼냅니다. 예를 들어, 1 밀리리터의 비드 현탁액을 제조하기 위해, 20 밀리그램의 비드를 함유하는 부피를 인출한다.
비드 현탁액을 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 상청액을 제거합니다. 동일한 부피의 I형 물로 비드를 2회 세척하고, 세척 용액을 각각 첨가한 후 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합한다. 그런 다음 용액을 마그네틱 랙에 다시 1분 동안 놓고 앞과 같이 상층액을 제거합니다.
마그네틱 비드에 항체 결합을 위한 산 처리된 항체, 0.5몰 붕산염 완충액 및 결합 완충액을 추가합니다. 소용돌이 믹서를 사용하여 혼합하고 엔드 오버 엔드 샘플 믹서를 사용하여 밤새 주변 온도에서 회전하며, 가급적이면 왕복 회전 및 진동을 가급적이면 회전시킵니다. 이어서, 239 g에서 10분간 원심분리한다.
튜브를 자석에 2 분 동안 놓고 상청액을 제거합니다. 비드를 세척한 후 튜브를 다시 자석에 1분 동안 놓고 동일한 절차에 따라 상청액을 제거합니다. 냉장고에서 원하는 스톡 농도의 비드를 사용하여 원하는 버퍼에 보관하십시오.
제조업체의 지침에 따라 10마이크로리터 체적 흡수 마이크로샘플링(VAMS) 팁에 10마이크로리터의 혈청을 수집하고 주변 온도에서 최소 2시간 동안 자연 건조합니다. 홀더에서 VAMS를 제거하고 2밀리리터의 저단백질 결합 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 1, 000 마이크로 리터의 100 밀리몰 암모늄 중탄산 용액을 첨가하고, 1, 000 rpm에서 온도 제어 믹서를 사용하여 섭씨 22도에서 1 시간 동안 VAMS를 추출한다.
트립신 단백질 분해를 위해 추출물을 새로운 1.5밀리리터 저단백질 결합 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세척된 트립신 비드 30마이크로리터를 각 VAMS 추출물에 첨가하여 소화를 시작하고, 온도 제어 믹서 또는 이와 유사한 것을 사용하여 섭씨 37도 및 1, 000rpm에서 2시간 동안 배양합니다. 2, 655g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 새로운 2밀리리터 저단백질-결합 마이크로원심분리기 튜브로 옮긴다.
100밀리몰 암모늄 바이카보네이트 용액에 안정 동위원소 표지 펩타이드를 포함하는 내부 표준물질(IS )당 14마이크로그램 25마이크로리터를 추가합니다. 20 마이크로리터의 세척된 마그네틱 비드 현탁액을 소화된 VAMS 추출물 및 IS가 들어 있는 각각의 저단백질 결합 미세원심분리 튜브에 추가합니다. 주변 온도에서 엔드 오버 엔드 샘플 혼합기를 사용하여 1시간 동안 면역추출을 수행합니다. 500 마이크로 리터의 PBS를 0.05 % 폴리 소르 베이트 20으로 첨가하여 자성 비드를 세척하십시오.
비드가 들어 있는 저단백질 결합 미세 원심분리기 튜브를 제거하고 마그네틱 랙에서 용액을 세척하고 균질해질 때까지 조심스럽게 뒤집습니다. 그런 다음 저단백질 결합 미세 원심분리 튜브를 자석에 30초 동안 놓고 30초 동안 뒤집었다가 다시 자석에 1분 동안 놓습니다. 세척 용액을 제거하고 PBS, 트리스 염산 및 중탄산 암모늄으로 마그네틱 비드를 다시 세척합니다.
각 샘플에 유형 I 물에 2 % 포름산 15 마이크로 리터를 첨가하고 섭씨 22도 및 온도 제어 믹서 또는 이와 유사한 것을 사용하여 1, 000 rpm에서 5 분 동안 배양하여 포획 된 펩타이드를 용출시킵니다. 용리액을 자석에 1분 동안 놓은 후 새로운 1.5밀리리터 저단백질 결합 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다. 한 번 반복하고 두 번째 용출액을 첫 번째 용출액과 동일한 저단백질 결합 미세 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
각 용출액에 20마이크로리터의 100밀리몰 중탄산암모늄을 추가합니다. 원심분리하고 용리액 40마이크로리터를 HPLC 바이알용 마이크로인서트로 옮깁니다. 기기 소프트웨어에서 컬럼 오븐 온도를 섭씨 25도로 설정하고 유량을 분당 50마이크로리터로 설정합니다.
그런 다음 샘플을 자동 시료 주입기에 넣습니다. LC-MS/MS 시스템에 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 실행할 샘플이 포함된 시퀀스를 준비하고 주입 부피를 10마이크로리터로 설정합니다. 기기 소프트웨어에서 Run Sequence를 눌러 시퀀스를 시작하고 친화성 캡처, ProGRP 특이적, 트립신 펩타이드 및 IS의 피크 면적을 기록합니다. VAMS 및 건조 혈청 스팟 또는 DSS, 샘플링 후 단백질형 펩타이드 및 IS의 질량 분석법 또는 MS, 크로마토그램 및 추출 용액에 직접 첨가된 스파이크된 혈청 샘플에 대한 크로마토그램이 여기에 표시됩니다.
ProGRP가 스파이크되고 VAMS, DSS 또는 추출 용액에 직접 적용된 혈청 샘플에 대한 IS에 대한 Proteotypic ProGRP 펩타이드의 피크 면적 비율의 대표적인 결과가 이 그림에 나와 있습니다. 이러한 결과로부터, VAMS는 대조 시료와 유사한 면적 비율을 제공하여 샘플링 물질에 대한 손실이 없음을 나타내는 반면, DSS는 현저히 낮은 면적 비율을 제공하여 시료 채취 물질에 대한 손실을 나타낸다는 것을 알 수 있습니다. 원형(intact) 단백질 추출과 프로테오타입 에피토프 펩타이드 추출 후의 염기 피크 크로마토그램을 비교한 것이 이 그림에 나와 있습니다.
항체 또는 효소 코팅 비드를 직접 준비할 때 특정 요구 사항에 맞게 비드를 맞춤화할 수 있습니다. 이는 표적 단백질 측정 및 글로벌 단백질체학 분석과 관련이 있습니다. VAMS 및 건조된 혈반을 이용한 단백질 측정의 민감한 분석법은 광범위한 질병의 추적 관찰에서 병원 밖 검사와 같은 환자 중심의 접근 방식을 가능하게 합니다.
