이 프로토콜은 단백질 수준에서 비 근육 myosin 역학을 특성화하는 데 사용할 수 있으며, 이는 세포에서자신의 역할에 기여하는 motile 특성을 알릴 수 있습니다. 이것은 그들의 세포 행동을 알리는 myosin 운동성에 각종 규제 조건의 효력을 연구하기 위하여 이용될 수 있는 빠르고 재현가능하고, 높게 통제된 방법입니다. 이 기술은 비 근육 myosins에 있는 질병을 일으키는 돌연변이가 단 하나 분자 및 앙상블 수준에 그들의 행동에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
그 방법론의 일반적인 접근은 마이크로 투부로 정제 된 키네신과 다인의 특성화와 같은 다양한 다른 사이토스켈레탈 시스템에 적용 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 다재다능함은 어떤 형광과 화학 조건이 가장 적합한지에 대한 의문을 제기할 수 있지만 이 방법은 비교적 빠르게 최적화될 수 있습니다. 유동 챔버를 설정하고 코팅하는 방법을 이해하면 이러한 실험에 대한 다양한 조건에 적응할 수 있는 강력한 토대가 됩니다.
시작하려면 아밀 아세테이트에 1% 니트로셀룰로오스 용액을 준비하고 조직 배양 판 바닥에 125밀리미터 직경의 원형 필터 용지를 놓습니다. 8 평방 커버를 랙에 적재하고 200개의 에탄올을 약 2~5밀리리터로 철저히 세척한 다음 증류수 2~5밀리리터를 세척합니다. 그런 다음 여과 된 공기 라인이나 질소 라인을 사용하여 덮개 전표를 완전히 운전하십시오.
1% 니트로셀룰로오스 용액의 10 마이크로리터가 하나의 커버 슬립의 가장자리를 따라 천천히 파이펫 10 마이크로리터. 200 마이크로리터 파이펫 팁의 측면을 사용하여 커버 슬립의 나머지 부분을 한 번의 부드러운 동작으로 얼룩지게 합니다. 그런 다음 니트로 셀룰로오스 측으로 조직 문화 접시에이 커버 슬립을 놓습니다.
나머지 덮개 전표에 대해 이 것을 반복하고 건조시키십시오. 광학 렌즈 용지로 현미경 슬라이드를 닦아 큰 이물질을 청소합니다. 양면 테이프 2장, 길이 약 2cm를 자르고 현미경 슬라이드의 긴 가장자리를 따라 한 조각을 놓습니다.
두 번째 테이프를 테이프의 첫 번째 조각 아래에 약 2밀리미터 아래에 두 어두워서 두 개가 평행하게 하여 약 10 마이크로리터의 용액을 보유할 수 있는 유량 챔버를 생성합니다. 니트로셀룰로오스로 코팅된 측면이 테이프와 직접 접촉하도록 테이프에 니트로셀룰로오스 커버 슬립 중 하나를 조심스럽게 붙입니다. 파이펫 팁을 사용하여 슬라이드 테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 커버 슬립이 슬라이드에 적절하게 부착되도록 합니다.
그런 다음 면도날로 슬라이드 가장자리에 걸려있는 여분의 테이프를 잘라냅니다. 묘신 5a용 솔루션을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 미오신 5a의 마이크로리터 10개에서 슬라이드 플로우 챔버를 통과하여 1분간 기다립니다.
그런 다음 DTT를 사용하면 운동성 버퍼에서 밀리리터 BSA당 1밀리그램의 10 마이크로리터로 흐르고 있습니다. 이 두 번 반복하고 세 번째 세척 후 1 분 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 용지 모서리를 유동 챔버 출구에 부드럽게 배치하여 채널을 통해 용액을 심지합니다.
그런 다음 DTT로 10 마이크로리터의 운동성 버퍼로 세척하십시오. 1 밀리리터 주사기와 27 게이지 바늘로 블랙 액틴 용액을 피펫하여 챔버에 해당 솔루션을 도입하기 전에 액틴 필라멘트를 전단합니다. 1 밀리머 DTT와 50 밀리머 MB에 하나의 밀리머 ATP의 존재챔버에 검은 액틴을 추가합니다.
다음으로, DTT와 1 밀리머 ATP를 사용하여 50 마이크로리터의 운동성 버퍼로 흘러 들어와 무료 액틴 필라멘트의 챔버를 고갈시다. DTT로 10 마이크로리터의 운동성 버퍼로 세척하여 ATP의 챔버를 고갈시다. DTT와 운동성 버퍼를 포함하는 20 나노 몰라 RH 액틴 용액의 10 마이크로 리터로 플로우하고 커버 슬립의 표면에 부착 된 Myosin 5a에 actin 필라멘트의 엄격한 결합을 허용하기 위해 1 분 동안 기다립니다.
DTT로 50 밀리머 운동 완충제 10마이크로리터로 세척하여 언바운드 RH 액틴 필라멘트를 제거합니다. 최종 버퍼의 30 마이크로리터로 플로우합니다. 561 나노미터의 난초 파장을 사용하여 형광 현미경에 이미지를 기록하여 RH 액틴을 시각화합니다.
Myosin 5a 반전 운동성 분석에 대한 솔루션을 준비하고 얼음에 보관하십시오. DTT로 10 마이크로리터의 운동성 완충제로 챔버를 세척합니다. DTT를 사용하는 운동성 버퍼에서 밀리리터 BSA당 1밀리그램의 10마이크로리터로 플로우합니다.
세 번째 세척 후 1분 동안 기다리며 두 번 반복하십시오. 조직 또는 필터 용지를 사용하여 용지 모서리를 유동 챔버 출구에 부드럽게 배치하여 채널을 통해 용액을 심지합니다. 그런 다음, DTT로 운동완충제 10마이크로리터로 챔버를 세 번 세척한다.
DTT를 사용하는 운동성 버퍼에서 NeutrAvidin 용액의 10 마이크로리터를 플로우하고 1분 동안 기다립니다. 그런 다음 10 마이크로리터의 용액을 세 번 으로 씻으시면 됩니다. 큰 지루한 파이펫 팁을 사용하여 DTT와 운동성 버퍼를 포함하는 BRH 액틴의 10 마이크로 리터에 흐름.
그리고 1 분 동안 기다립니다. 그런 다음 DTT로 10 마이크로리터의 운동성 버퍼로 세워주세요. 10 나노 몰러 Myosin 5a와 최종 버퍼의 30 마이크로 리터에 흐름.
그리고 즉시 총 내부 반사 형광 현미경에 로드합니다. TIRF 이미징에 대한 최적의 초점이 발견되면 녹화를 시작합니다. 비근육 묘신 2b, 필수 광체인, 규제 광사슬, 묘신 5a 및 칼모둘린의 정제는 SDS-PAGE를 수행하여 평가하였다.
글라이딩 액틴 필라멘트 분석법은 라벨이 붙은 액틴 필라멘트의 매끄러운 움직임을 특징으로 하는 이상적이고 추적 가능한 영화의 특징을 보여줍니다. 블랙 액틴 워시는 죽은 미오신 헤드가 측정 분야에서 제거되어 액틴 필라멘트의 전반적인 매끄러운 움직임에 더욱 기여했습니다. 빠른 트랙 프로그램에서 필라멘트 추적 출력 이미지는 비 근육 Myosin 2b와 Myosin 5a에 대한 얻어졌다.
대표적인 히스토그램은 Actomyosin 2b 글라이딩 속도가 초당 77 나노미터임을 보여줍니다. 그리고 Actomyosin 5a의 것은 초당 515 나노미터입니다. 메틸셀룰로오스가 없는 경우, 액틴 필라멘트는 미오신 코팅 된 표면에 의해 밀접하게 연관되어 있지 않아 근육이 아닌 Myosin 2b 코팅 커버 슬립의 표면에 가깝게 펄럭입니다.
미신 운동은 반전된 운동성 분석법을 사용하여 표면에 테더링된 형광액트인 필라멘트에서 관찰되었다. 라벨이 부착되지 않은 액틴을 전단하는 것이 중요하며, 이를 블랙 액틴 세척용 유동 셀에 도입하여 액틴의 원활한 전좌를 허용하는 것이 중요합니다. 추가 실험은 myosin 운동성 근신 돌연변이, 하중 유도 단백질, 이온 강도 및 규제 단백질에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사할 수 있습니다.
다양 한 세포 조건 미래 연구에 대 한 재구성 될 수 있습니다. 이러한 방법은 단일 분자 및 앙상블 수준에서 다양한 myosin 등류가 어떻게 변하는지에 대한 생화학적 및 생물리학적 조사를 허용합니다.
