여기서 제시하는 것은 프로메타단계에서 동기화된 세포에서 라이브 셀 방적 디스크 공초점 이미징을 사용하여 미세tubule 역학을 분석하는 강력하고 간단한 방법이며, 이후 MATLAB 기반 플랫폼에서 이미지를 분석합니다. 회전 디스크 현미경 검사법과 함께 적변형 단백질을 사용하면 광독성이 줄어듭니다. 따라서, 더 많은 수의 셀이 동일한 준비 내에서 이미지화될 수 있다.
미세 투골 역학은 많은 수의 병리학 적 조건에서 변경됩니다. 따라서, 그 프로세스에 있는 microtubule 역학의 규정 그리고 행동을 이해하는 것은 우리가 질병의 기계장치를 이해하는 것을 도울 수 있고, 결국, 그(것)들을 보상하기 위하여 치료를 개발하는 것을 도울 수 있습니다. 그리고 이 방법은 또한 확장가능하므로 잠재적으로 약물 발견 노력에 적용될 수 있습니다.
이 방법은 형광 비동기화 프로토콜을 변경하고 세포 주기의 상이한 단계에서 세포를 획득하여 변형될 수 있다. 이것은 microtubules에 대하여 약을 검열하고 분할 및 비 분할 세포에 결함을 확인할 때 유용할 수 있습니다. 각 셀 유형에 대한 전환 프로토콜 및 시드 밀도를 최적화할 필요가 있습니다.
EB3의 발현 수준은 단일 성장하는 마이크로투블러를 검출하기 위해 낮어야 합니다. DPBS에서 비동기적으로 성장하는 HeLa 세포를 헹구는 것으로 시작한 다음 섭씨 37도에서 트립신-EDTA로 5분 동안 배양합니다. 3 대 1 비율로 10 %의 열 비활성화 FCS로 보충 RPMI-1640 매체를 추가하여 트립시니화를 중지, 추가 트립신-EDTA.
원고 방향에 따라 세포의 농도를 계산하고, 50, 000 세포를 준비된 챔버 커버슬립의 각 웰에 계산한다. 커버슬립을 인큐베이터에 반환하고, 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 성장시다. 다음 날, 인큐베이터에서 세포를 제거하고, 드롭 와이즈는 각 우물에 100 마이크로 리터의 형질 혼합물을 추가합니다.
세포를 인큐베이터로 되돌리고 4시간 동안 배양한 후 세포를 신선한 배지로 보충하고 20시간 동안 추가로 배양합니다. 10%FCS와 2밀리몰러 L-글루타민으로 보충된 페놀 레드 프리 DMEM에서 디메틸렌스트론(dimethylenastron) 또는 DME의 2.5 마이크로몰라 용액을 준비합니다. 챔버 커버슬립의 성장 배지를 DME 성장 배지로 대체하고 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다.
3.5시간의 배양 후 챔버 커버슬립을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정하여 현미경으로 세포를 옮기고, 이미징을 위한 어두운 패널을 장착한다. 그런 다음 총 4 시간 동안 인큐베이션을 계속하십시오. 100X, 1.49 숫자 조리개, 오일 침수 목표, 듀얼 디스크 공초점 시스템 및 신뢰할 수 있는 자동 초점 시스템으로 반전된 현미경으로 시간 경과 이미징을 수행합니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 이미징 매개 변수를 정의합니다. 단극성 미토틱 스핀들의 중심에 대응하는 Z 평면에 세포를 찾아서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 총 1분 동안 5초마다 이미지를 획득하고, 비닝이 없고 노출 사이에 조명이 없습니다.
먼저 수치 분석 소프트웨어를 로드하고 명령 창에서 영화 선택기 GUI라고 하는 소프트웨어 검색 경로에 u-track V2.0 폴더를 추가합니다. 그런 다음 이미지 수집 소프트웨어에 의해 생성된 원시 파일을 가져옵니다. 수동으로 목표의 숫자 조리개와 이미징에 사용되는 시간 간격을 입력합니다.
모든 이미지가 로드되면 동영상 목록으로 저장하고 대화 창 오른쪽에 있는 U-track 옵션을 선택하여 입력된 타임랩스 시리즈를 영화로 저장합니다. 팝업 메뉴에서 microtubule 플러스 끝을 선택하고 새 대화 창을 열어 분석의 세 단계의 매개 변수를 결정하는 확인을 클릭합니다. 1단계의 경우 설정을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 혜성 탐지를 선택합니다.
원고에 설명된 대로 가우시안 필터와 분수령 분할의 차이에 대한 매개변수를 정의합니다. 그런 다음 모든 동영상에 적용 설정을 선택하고 적용을 클릭합니다. 2단계의 경우 마이크로튜브 플러스 엔드 역학을 선택하고 텍스트 원고에 따라 설정 옵션을 사용하여 연결, 갭 클로징, 병합 및 분할 및 Kalman 필터 함수의 값을 정의합니다.
치수 문제의 경우 드롭다운 메뉴에서 2개를 선택하고 최대 간격을 닫을 수 있도록 5프레임을 사용하고 첫 번째 단계에서 최소 트랙 세그먼트 길이에 3프레임을 사용합니다. 이전과 마찬가지로 모든 동영상에 설정 적용을 선택하고 적용을 클릭합니다. 3단계의 경우 마이크로튜블러 역학 분류를 트랙 분석 방법으로 선택하고 설정 단추를 통해 매개변수를 정의합니다.
영화의 시작과 끝에 트랙을 제거하고 통계 히스토그램을 만들기 위해 상자를 선택합니다. 드롭다운 목록에서 전방 간격 전에 2~3프레임, 전방 갭 속도 분포의 95번째 백분위수를 사용하여 앞뒤로 재분류할 수 있습니다. 모든 매개 변수가 정의되면 모든 동영상에 확인/선택 취소를 선택하고 컨트롤 창 U-track 창에서 모든 동영상 상자를 실행한 다음 실행을 누릅니다.
동영상 처리가 완료되면 메시지가 표시됩니다. pEB3-tdTomato 플라스미드는 HeLa 세포에서 일시적으로 발현되었다. 세포는 DME 처리와 동기화되었습니다.
미세수염 성장의 시간 경과 영화를 분석하고, 결과 성장 속도와 역학을 플롯했다. 최대 갭 길이 및 최대 수축 계수와 같은 분석에 영향을 미치는 매개 변수는 동일한 시간 경과 동영상 집합에 대해 수정되었습니다. 성장 속도와 역학의 해당 값을 계산했습니다.
결과 성장 속도는 크게 영향을 받지 는 않았지만 최대 갭 길이가 수정되었을 때 역학이 달랐습니다. 세 가지 경우 모두, 마이크로튜블러 서브트랙의 검출은 유사했지만, 최대 갭 길이가 15로 설정되었을 때 전체 MT 궤적의 재구성은 대부분 영향을 받았다. 이미징 조건이 미세투하 거동을 방해했는지 여부를 평가하기 위해 타임랩스 시리즈의 첫 번째 및 두 번째 반쪽을 별도로 분석하고 해당 성장 속도 및 역학을 비교했습니다.
예상대로, 중요한 차이점이 감지되지 않았습니다. 세포가 프로메타단계에서 동기화되기 때문에 미세 투덜의 밀도가 매우 높다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 다른 마이크로튜블러를 잘못 식별하지 말고 분석의 매개 변수를 매우 신중하게 설정해야 합니다.
이 방법을 사용한 미세 tubule 역학의 측정은 마이크로 튜블러를 직접, 간접적으로 조절하는 다른 생물학적 표적의 연구와 비교할 수 있습니다.
