헌팅턴병 헌팅턴병헌병은 헌팅틴 단백질을 인코딩하는 유전자의 돌연변이로 인한 난치성 신경퇴행성 병리학이다. 헌팅틴은 주로 소포 및 마이크로튜부와 관련이 있으며, 아마도 마이크로튜브에 의존하는 운송 공정에 관여할 것입니다. 소우주의 역동성에 돌연변이 헌팅틴의 영향을 연구하기 위해, 우리는 성장하는 플러스 엔드를 구부리고 안정화하여 마이크로투블러의 동적 특성을 조절하는 EB3 단백질의 생체 시각화에 사용했습니다.
형광으로 표시된 EB3를 인간 피부 섬유아세포에 적재하기 위해 플라스미드 트랜스펙션을 적용했습니다. 우리는 이 연구를 위한 EB3 환자의 피부 생검에서 얻기 위하여 1 차적인 섬유아세포 문화를 이용했습니다. DMEM 배지에서 몇 시간 이내에 실험실에 생검을 전달, 보충 15 페니실린의 밀리 리터 당 마이크로 그램, 그리고 50 연쇄 상 혈 의 밀리 리터 당 단위.
생검 조직을 6센티미터 페트리 접시에 소량의 배지와 함께 놓습니다. 멸균 메스를 사용하여 생검 샘플을 약 0.5~1밀리미터 크기로 잘라냅니다. 1, 2, 얻은 조각을 3.5 센티미터 페트리 접시에 넣고 멸균 커버 슬립을 생검 조각 위에 놓습니다.
천천히 성장 매체의 1.5 밀리리터를 추가합니다. CO2 인큐베이터의 성장 배지에서 배양 섬유폭발은 7센트, 습도 80%인 5%CO2로 합니다. 4 일, 7 일 후, 첫 번째 각질 세포, 다음 섬유 아세포는 접시의 바닥으로 조직에서 이동하기 시작합니다.
세포 재배. 트랜스페션 시각화, 유리 공초점 접시, 공초점 요리를 사용해야합니다. 증류수에 제조된 오토클레이브 0.1%젤라틴 용액으로 접시 바닥을 덮습니다.
15분 동안 배양합니다. 문화 매체를 준비한다. 철저하게 혼합, 플러스 4 섭씨에 키가 저장합니다.
세포에 추가하기 전에 중간을 플러스 37 섭씨로 따뜻하게합니다. 현미경의 밑에 문화를 평가합니다. 매체를 제거하고 멸균 DPBS로 세포를 씻으시다.
전동된 0.25%의 트립신 용액을 셀에 1밀리리터를 추가합니다. 그들은 완전히 기판에서 분리 하는 경우 현미경 아래 세포를 확인. 배양 배지의 1밀리리터로 트립신을 비활성화합니다.
세포 현탁액을 15 밀리리터 원내 튜브로 옮기다. 5 분 동안 200 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 배양 배지의 1 밀리리터에서 셀 팔레트를 다시 분리합니다.
셀 번호를 계산합니다. 필요한 셀 수를 계산합니다. 8~15의 밀도로 시드를 드시드하고, 10을 곱하여 3분의 1의 힘에 곱하고, 센티미터로 통과하였다.
이것은 배양 매체의 밀리리터로 패닝됩니다. 접종을 위해 준비된 배양 접시에서 젤라틴 용액을 제거하고 즉시 세포 현탁액의 2 밀리리터를 추가합니다. CO2 인큐베이터에서 섬유아세포와 37센티미터의 섬유아세포를 재배합니다.
2일, 4일마다 미디어를 새로 고칩니다. 실험의 경우 4개, 11개의 구절의 세포를 사용하십시오. 배분시까지, 결합은 70, 80%가 배양 배지를 트랜스펙트 24시간 전에 신선한 것으로 교체해야 한다.
세포 파종의 면적과 밀도에 기초하여 DNA 지질 복합체를 준비한다. 리포소말 형질 전환제, 세포의 밀도는 10을 곱하여 4개의 세포의 힘에 곱하고, 센티미터에 의해 통과되었다. 항생제를 함유하지 않는 Opti-MEM의 125마이크로리터에 상업용 시약 3개를 추가합니다.
튜브 벽을 건드리지 않고 부드럽게 다시 중단하십시오. Plasmid DNA, GFP-EB3를 희석하고, OptiMEM의 125 마이크로리터에 플라스미드 DNA의 1마이크로그램을 추가합니다. 부드럽게 다시 중단합니다.
희석 된 플라스미드 DNA를 희석 된 형질 전환 시약의 각 튜브에 1 대 1 비율로 추가합니다. 30분 동안 배양하세요. DNA 지질 복합체를 세포와 함께 6센티미터 페트리 접시에 넣습니다.
30초 동안 십자형 스윙과 섞으세요. 24시간 동안 형질산제로 세포를 배양한 다음 배지를 신선한 것으로 변경합니다. 검사 후 24시간 및 48시간 의 효율을 분석합니다.
이미징 을 준비하고 있습니다. 세포의 라이브 이미징 전에, 자동 형광을 줄이기 위해 PH 지표 염료없이 배지로 배양 매체를 변경합니다. 매체를 완전히 커버하기 위해 중간 세포 상에 미네랄 오일을 신중하게 적용하여 외부 환경으로부터 분리하여 O2 침투를 줄이고 중간 증발을 줄입니다.
매크로 램프와 모든 이미지를 60배, 100배의 객관적인 렌즈에 높은 숫자 조리개가 사용하여 이미지를 찍습니다. 생체 내 관찰의 경우, 현미경은 광학 테이블에 부딪히는 것을 포함하여 세포에 필요한 조건을 유지하기 위해 인큐베이터를 장착해야 하며, 렌즈는 37 Centigrade를 통과하고, 폐쇄 챔버는 CO2 공급, 습도 수준 지원이었다. 화상 진찰 전에 현미경의 홀더에 있는 세포와 공초점 접시를 놓습니다.
접시와 카메라가 이미지를 촬영하는 동안 표류하지 않도록 홀더에 단단히 부착되어 있는지 확인합니다. 이미징 매개 변수를 설정합니다. 슬라이드가 세포 손상을 유도하고 산소 공간과 반응하기 때문에 낮은 노출 값을 선택합니다.
인간의 피부 섬유아세포에서 마이크로투볼의 역학을 연구하기 위해 300밀리초 노출을 선택했습니다. 관심 있는 대상에 집중합니다. 오랜 시간 경과 이미징의 경우, 자동 초점 안정화 시스템, 완벽한 초점 시스템이 필요하며, 설정 축을 따라 이동이 있을 수 있으므로 관심 있는 개체는 초점이 부족합니다.
셀의 감광성 및 플레어 크롬 페이딩 속도에 따라 최적의 이미징 조건을 선택합니다. 마이크로튜브는 매우 역동적인 구조이므로 합리적으로 짧은 시간을 선택할 수 있으며 프레임 속도가 충분히 높어야 합니다. 피부 섬유아세포의 미세투막 역학을 조사하기 위해, 우리는 3, 5 분 동안 초당 1 프레임의 주파수를 사용했습니다.
이미지를 얻기 위해 다음 개체를 선택할 때, 빛의 영향으로, 경과 사진 출혈이 있기 때문에, 이미 이미지 된 영역에서 멀리 이동합니다. 우리는 상대적으로 높은 이미징 주파수를 사용 했기 때문에 셔터는 이미지 사이에 닫히지 않았고 램프는 화상 진찰의 전체 기간 동안 늦었으며, 이는 퇴색하고 있습니다. 현미경 역학을 시각적으로 연구하기 위한 최적의 비디오를 선택하여, 형질, 마이크로투알 이미지의 품질, 최적의 신호 대 잡음 비율 및 분석 된 셀의 표류의 부재를 고려하십시오.
선택한 비디오를 사용하여 피지 프로그램에서 저울스터를 사용하여 마이크로투블러 플러스 엔드 역학을 연구하십시오. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 충분한 단백질 발현을 보장하는 트랜스페션입니다. 좋은 신호 대 잡음 비율, 마이크로 투튜블의 광표백, 세포 표류의 부재는 이미징에 매우 중요합니다.
마이크로튜버 역학의 생체 내 시각화는 돌연변이 헌팅틴의 특성에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 우리의 프로토콜은 병리학이 세포 골격의 동적 특성을 연루하는 다른 질병의 연구에 적용 될 수 있습니다.
